陳旭升，趙龍飛，趙 亮，狄佳春

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

0 引言

棉花葉片是棉株最主要的光合作用與蒸騰作用的場(chǎng)所，還具有儲(chǔ)存光合產(chǎn)物與吸收外來營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能[1]，也是一種突變多發(fā)的器官。比如葉形突變體有雞腳葉[2-3]、皺縮葉[4-7]、波狀葉[8]與圓葉[9]；葉色突變體有花葉[10-11]、紅葉[12]、亞紅葉[13]與芽黃[14-16]；葉片茸毛突變體有多毛葉與光葉[17-18]等。合理利用葉片突變體可以擴(kuò)充種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)突變體也常被用來開展功能基因組研究[19]。

杯狀葉(cup leaf)是一種比較古老的葉形突變體，它的葉片邊緣向上卷，形狀似杯子。1939年Yu[20]報(bào)道在亞洲棉‘小百花’品種中發(fā)現(xiàn)一種杯狀葉突變體，株高正常，真葉很小時(shí)就呈杯狀，葉邊緣向上并向里卷曲。遺傳研究表明，該杯狀葉突變受一對(duì)完全隱性基因控制。1954年Lewis[21]報(bào)道在陸地棉‘Stoneville 2B’棉田里發(fā)現(xiàn)一棵杯狀葉突變體棉株，苞葉略微卷曲，花瓣不能像正常棉花一樣完全開放。遺傳研究結(jié)果表明，該杯狀葉是由一對(duì)隱性基因cu控制的質(zhì)量性狀，與正常葉雜交其F1表型呈中間型。Kohel[19-22]在一個(gè)陸地棉杯狀葉材料中發(fā)現(xiàn)了超杯狀葉的突變體，經(jīng)過細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，該突變體是一個(gè)三體，通過易位雜交，鑒定出重復(fù)的染色體是A染色體組的第4號(hào)染色體，但遺傳試驗(yàn)表明超杯狀基因并不位于重復(fù)的第4號(hào)染色體上。

經(jīng)典隱性遺傳標(biāo)準(zhǔn)系T582含有5個(gè)隱性標(biāo)記基因——芽黃(v1)、杯狀葉(cu)、無腺體(gl1)、窄卷苞葉(fg)、叢生鈴(cl1)，分別隸屬5個(gè)連鎖群[23]，其中杯狀葉突變基因cu一直未被定位到特定的棉花染色體。直到2017年，Zhu等[24]通過集團(tuán)分離加測(cè)序的技術(shù)(BSA-seq)將T582中的cu基因錨定到棉花chr.11。本研究依據(jù)在大田自主鑒定的一個(gè)綠色杯狀葉突變系，對(duì)其進(jìn)行表型特性的觀察與遺傳分析，并采用SSR分子標(biāo)記對(duì)該突變基因進(jìn)行分子定位，旨在為該突變體未來實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年利用自主發(fā)現(xiàn)的杯狀葉突變系‘R169’，與海島棉親本‘勝利1號(hào)’雜交，得雜交F1。2016年種植F1，自交加代，得雜交F2群體。而后種植海陸雜交親本以及雜交F1、F2群體，用于分析杯狀葉突變基因的經(jīng)典遺傳學(xué)規(guī)律；并以海陸雜交F2作為定位群體，用于杯狀葉基因的染色體定位，定位群體為110個(gè)單株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片子DNA的提取 在大田取親本以及雜交F1、F2的頂部嫩葉，采用Paterson等[25]的方法提取葉片DNA。

1.2.2 多態(tài)性標(biāo)記篩選 使用的SSR引物序列均來自網(wǎng)站https://www.cottongen.org/。在F2代分離群體，選取正常葉單株10個(gè)，突變體杯狀葉單株10個(gè)。然后用ScanDrop 250超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定選取個(gè)體的DNA濃度，統(tǒng)一稀釋成40 ng/μL后，吸取等體積的DNA溶液，構(gòu)建近等基因混池。利用本實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得的分布于棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)核心引物[26-27]，對(duì)雙親以及近等基因混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選多態(tài)性SSR引物。

1.2.3 突變基因的染色體定位 基因的染色體定位采用陳旭升等[28]研發(fā)的棉花單位點(diǎn)質(zhì)量基因在染色體的快速定位方法。以海陸F2定位群體構(gòu)建的近等基因混池，篩選獲得具有多態(tài)性的引物，檢測(cè)由隱性基因（杯狀葉突變）混池的9個(gè)單株、P1(‘R169’)、P2（‘勝利1號(hào)’）以及F1共12個(gè)樣本組成的小群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)非變性PAGE凝膠電泳，通過銀染染色逐一記錄它們的帶型。統(tǒng)計(jì)隱性混池的9個(gè)單株與隱性親本P1的帶型一致的個(gè)體數(shù)，計(jì)算擬合率。選出其中與P1帶型一致，擬合率在60%以上的引物。然后用這些引物檢測(cè)F2分離群體，統(tǒng)計(jì)帶型，經(jīng)JionMap 4.0軟件分析，以快速鎖定與突變基因連鎖的目標(biāo)SSR引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 杯狀葉突變體的鑒定

2013年在南京江蘇省農(nóng)科院棉花試驗(yàn)地（南京），在陸地棉種質(zhì)系P003群體中，發(fā)現(xiàn)1棵淡棕絮突變株。2014年繼續(xù)在南京試驗(yàn)地種植該突變株，在株行群體中發(fā)現(xiàn)有綠色杯狀葉變異株，單株編號(hào)Q150-4-3（圖1）。

圖1 杯狀葉突變株在大田的表型特征

2015年將杯狀葉株Q150-4-3種植成株行，編號(hào)R169。在大田觀察該株行群體的杯狀葉純度達(dá)100%。在開花期觀察該綠色杯狀葉株行的花瓣，其開放不完全，屬于半閉花授粉（圖2）。而后利用R169為雜交親本，配制雜交組合，用于杯狀葉突變性狀的遺傳規(guī)律分析。

圖2 杯狀葉突變體不同組織的表型特征

2.2 杯狀葉突變體的遺傳

取海陸雜交組合‘勝利1號(hào)’בR169’的雜交親本及F1、F2群體的種子，采用營(yíng)養(yǎng)缽苗床育苗，然后移栽大田種植。初花期在大田統(tǒng)計(jì)4個(gè)世代群體中葉形性狀的分離情況見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，母本‘勝利1號(hào)’全部個(gè)體均表現(xiàn)為正常葉形，父本‘R169’全部個(gè)體均表現(xiàn)為杯狀葉形。F1代全部個(gè)體為正常葉形，F(xiàn)2代分離群體中正常葉形和杯狀葉形的個(gè)體數(shù)目擬合3:1的分離比例。說明杯狀葉突變體為單位點(diǎn)質(zhì)量性狀突變體，符合由一對(duì)隱性基因控制的孟德爾遺傳分離規(guī)律，擬將其基因符號(hào)暫定為cup。

表1 ‘R169’和‘勝利1號(hào)’雜交后代的葉形分離情況

2.3 杯狀葉突變體基因的染色體定位

在海陸雜交F2代分離群體，選取正常葉單株與突變體杯狀葉單株的DNA，構(gòu)建近等基因混池。利用234對(duì)分布于棉花26對(duì)染色體上的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，共得到34對(duì)多態(tài)性引物。以這34對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)來自隱性基因（杯狀葉突變）混池的9個(gè)單株、P1、P2以及F1共12個(gè)樣本組成的小群體，統(tǒng)計(jì)其中隱性混池的9個(gè)單株與隱性親本P1的擴(kuò)增帶型一致的個(gè)體數(shù)。結(jié)果顯示，與P1帶型一致率在60%以上的引物只有NAU3480、BNL1066，這2個(gè)引物就是與目的基因最大似然連鎖引物。此后以這2個(gè)引物檢測(cè)F2作圖群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型，通過Joinmap 4.0連鎖軟件分析顯示引物NAU3480、BNL1066均與目的基因cup連鎖：其中NAU3480與基因cup的遺傳距離較近，為0.3 cM；引物BNL1066與基因cup的遺傳距離較遠(yuǎn)，為11.3 cM。已知引物NAU3480、BNL1066均位于棉花第11染色體，據(jù)此推斷該cup基因位于第11染色體。查閱棉花分子遺傳圖譜，合成位于第11染色體的110對(duì)引物，通過對(duì)雙親DNA的PCR擴(kuò)增得到26對(duì)多態(tài)性引物。用這些引物檢測(cè)F2代群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型，然后通過軟件進(jìn)行遺傳連鎖分析，結(jié)果表明共有19對(duì)引物與基因cup連鎖，它們分別是引物NAU5192、 NAU3621、 NAU2118、 NAU1162、NAU3409、NAU2998、NAU3657、NAU1148、NAU3234、NAU2651、NAU2599、NAU2661、NAU1014、NAU3622、BNL1408、NAU4086、BNL1066、NAU3480、NAU5505?；騝up位于SSR分子標(biāo)記BNL1066與NAU3480之間，遺傳距離分別為9.3 cM和1.6 cM。由此，杯狀葉突變體基因被定位在棉花第11號(hào)染色體上，其連鎖遺傳圖譜如圖3所示。

圖3 杯狀葉突變體基因cup的連鎖遺傳圖譜

3 結(jié)論與討論

棉花經(jīng)典遺傳學(xué)對(duì)突變基因的定位方法，是使用顯性遺傳標(biāo)準(zhǔn)系T586和隱性遺傳標(biāo)準(zhǔn)系T582，通過配置相關(guān)雜交組合，在雜交后代分析目標(biāo)性狀與已知標(biāo)記基因的連鎖關(guān)系。由于以上2個(gè)遺傳標(biāo)準(zhǔn)系連鎖的形態(tài)標(biāo)記基因數(shù)太少，沒有覆蓋陸地棉所有染色體，因此其連鎖定位成功的概率很低[27]。經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)系T582具有cu基因，但一直未能定位在特定染色體上。直至2017年，Zhu等[24]基于集團(tuán)分離與測(cè)序技術(shù)(BSA-seq)，將遺傳標(biāo)準(zhǔn)系T582中的cu基因定位在棉花第11染色體上，但其錨定結(jié)果未見分子遺傳圖譜。本研究無需測(cè)序，利用SSR分子標(biāo)記，通過本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的專利技術(shù)，快速將杯狀葉突變基因定位在棉花第11染色體上，并繪制了SSR分子遺傳圖譜。至于本文定位的綠色杯狀葉突變體基因cup與T582中呈現(xiàn)芽黃的杯狀葉突變基因cu，是否屬于同一突變體基因，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

葉片適度卷曲有利于保持葉片挺立，提高光能利用率。前人試驗(yàn)結(jié)果表明，植物葉片的有效面積和厚度與光合速率呈正相關(guān)，同時(shí)較厚的葉片可以提高葉片的直立性，有利于密植，水稻高產(chǎn)品種往往把葉片的直立性作為其重要的選擇指標(biāo)[29]。在棉花中，杯狀葉突變體葉片具有卷起直立的特點(diǎn)，有利于提高群體葉面積指數(shù)，對(duì)提升棉花群體的光合效能可能是有利的，在棉花株型育種中是一個(gè)值得特別關(guān)注的形態(tài)性狀。