鄭義，李詩穎，糜心怡，陳琳，李闖，梁一凡

1(徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州，221018) 2(江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州，221018)

食源性生物活性肽被認(rèn)為是新一代的生物活性調(diào)節(jié)劑[1]，主要來源于動(dòng)物蛋白和植物蛋白。食源性生物活性肽不僅具有易消化吸收、安全性高的特點(diǎn)，還具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血脂和抗腫瘤等廣泛的生理功能，是極具開發(fā)利用潛力的功能因子[2-3]?；钚噪牡闹苽浞椒ㄖ饕谢瘜W(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和蛋白酶解法等，其中最常使用的是蛋白酶解法，已應(yīng)用于數(shù)百種食源性生物活性肽的制備[4-5]。

酒精性肝損傷是臨床上最常見的肝病之一，從單純性肝脂肪變性可進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化，酒精性肝硬化的死亡率占肝硬化死亡率的46.7%[17]。我國酒精性肝損傷的發(fā)病率逐年升高，由2000年的2.27%增加到2015年的8.74%，據(jù)估計(jì)，發(fā)病率將不斷升高[18]。酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激和炎性損傷被普遍認(rèn)為在該病的發(fā)生和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用[19-20]。攝入生物活性肽，拮抗酒精代謝誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎性損傷，被認(rèn)為是一種有效的輔助治療酒精性肝損傷的策略。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，玉米肽[21-22]、海洋膠原蛋白肽[23]和核桃低聚肽[24]等生物活性肽對(duì)酒精性肝損傷都有較好的保護(hù)作用。目前有關(guān)GBP對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究未見報(bào)道。

本研究建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，基于氨基轉(zhuǎn)移酶、血脂、促炎細(xì)胞因子、抗氧化酶和氧化損傷產(chǎn)物水平等生理生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，旨在為GBP的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏采自江蘇省邳州市；雄性昆明小鼠(20±2)g購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXY (魯) 20190003。

堿性蛋白酶(2.25×105U/g)，丹麥諾維信公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、IL-1β、IL-6和TNF-α，肝臟過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl group, PCG)試劑盒，南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽片(國藥準(zhǔn)字H20050667)，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

FA2104 N電子分析天平、723C可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BILON92-IID超聲波細(xì)胞破碎儀，上海比朗儀器有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏蛋白的制備

銀杏去殼后，60 ℃下烘干，粉碎過60目篩，石油醚脫脂，得到脫脂銀杏粉。采用超聲輔助堿提酸沉法制備銀杏蛋白。按液料比20∶1(mL∶g)將脫脂銀杏粉與去離子水混合，調(diào)節(jié)pH至10.0，超聲功率200 W，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間40 min。提取結(jié)束后，以3 500 r/min離心20 min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH至銀杏蛋白的等電點(diǎn)4.4，4 500 r/min離心20 min，將所得沉淀透析(截留相對(duì)分子質(zhì)量3.5 kDa)72 h，濃縮，冷凍干燥，得到銀杏蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測得純度為84.63%。

1.2.2 銀杏肽的制備

按液料比15∶1(mL∶g)將銀杏蛋白與去離子水配成懸液，沸水浴10 min滅內(nèi)源性酶；調(diào)節(jié)pH至8.5，加入4 000 U/g堿性蛋白酶，50 ℃振蕩酶解，期間不斷補(bǔ)加NaOH溶液，使pH恒定，待水解度至25%時(shí)終止反應(yīng)；酶解后調(diào)節(jié)pH至7.0，沸水浴5 min滅酶，8 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥后得到銀杏肽。水解度的測定采用甲醛滴定法[25]。

1.2.3 動(dòng)物分組與處理

該研究遵循的程序符合本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)。60只雄性昆明小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、3組GBP組和陽性對(duì)照組。低、中和高劑量GBP組分別灌胃GBP 50、100和200 mg/kg，連續(xù)21 d。陽性對(duì)照組每天灌胃100 mg/kg還原型谷胱甘肽；正常組和模型組每天灌胃等量去離子水。第22天，除正常組外，其余組小鼠每隔12 h灌胃體積分?jǐn)?shù)50%酒精(12 mL/kg)，連續(xù)3次[26-28]。末次灌胃12 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌摘取肝臟和脾臟，稱量小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量，根據(jù)臟器質(zhì)量與體質(zhì)量比，計(jì)算臟器系數(shù)。

1.2.4 血清生理生化指標(biāo)測定

小鼠眼眶后靜脈叢采血，37 ℃水浴1 h，3 500 r/min離心10 min，收集上清液即為血清，按照試劑盒說明書測定ALT、AST、TG、TC、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 肝臟抗氧化酶與氧化損傷產(chǎn)物水平測定

取肝臟，置于玻璃組織勻漿器，加入一定體積的生理鹽水，制備質(zhì)量濃度100 g/L組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測定CAT、GSH-Px、T-SOD、MDA和PCG水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)可反映肝脾腫大的程度，而肝脾腫大是酒精性肝損傷臨床上常見的癥狀[29]。由圖1可知，模型組小鼠血清肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露造成了小鼠肝脾腫大。與模型組相比，GBP組小鼠肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)顯著下降(P<0.05)，中劑量GBP組脾臟系數(shù)以及高劑量GBP組肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)恢復(fù)至正常組水平(P>0.05)，表明GBP緩解了酒精暴露導(dǎo)致的小鼠肝脾腫大。

圖1 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響Fig.1 Effects of G.biloba peptides on organ index in acute alcoholic liver injury mice *P<0.05，表示與模型組比較；#P<0.05，表示與正常組比較; (n=10)(下同)

2.2 對(duì)小鼠血清氨基轉(zhuǎn)移酶水平的影響

酒精既有脂溶性又有水溶性，極易造成細(xì)胞膜損傷，可改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜介電常數(shù)、流動(dòng)性、通透性等物理性質(zhì)發(fā)生變化，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[30-31]。ALT和AST分別存在于生物體肝細(xì)胞的胞漿和線粒體中，生理狀態(tài)下血清中ALT和AST水平極低；當(dāng)肝細(xì)胞膜受損后，ALT和AST滲漏至血清，導(dǎo)致血清ALT和AST水平急劇升高，ALT和AST水平是監(jiān)測肝功能是否受損的敏感標(biāo)志物。

圖2為GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響。模型組小鼠血清ALT和AST水平分別是正常組的3.8和4.7倍，2種氨基轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高(P<0.05)，表明酒精暴露造成了小鼠肝細(xì)胞受損，致使血清ALT和AST水平升高。

圖2 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT和 AST水平的影響Fig.2 Effects of G.biloba peptides on serum ALT and AST levels in acute alcoholic liver injury mice

GBP組小鼠血清ALT和AST活性顯著低于模型組(P<0.05)，且呈劑量依賴性，高劑量GBP組小鼠血清AST恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，提示GBP可緩解酒精暴露導(dǎo)致的小鼠肝細(xì)胞損傷。陽性對(duì)照還原型谷胱甘肽也能顯著降低小鼠血清中這2種氨基轉(zhuǎn)移酶的水平(P<0.05)。

2.3 對(duì)小鼠血清血脂水平的影響

脂質(zhì)代謝紊亂是酒精性肝損傷的常見癥狀，酒精代謝過程中可誘導(dǎo)脂肪變性，導(dǎo)致脂肪沉積在肝細(xì)胞中，同時(shí)酒精可影響血脂轉(zhuǎn)運(yùn)，造成血清TG和TC水平異常[32]。圖3為GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清TG和TC水平的影響。模型組小鼠血清TG和TC水平分別是正常組的2.2和2.5倍，顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，這與前人的研究結(jié)果一致[33-34]。給藥GBP后，小鼠血清TG和TC水平顯著低于模型組，表明GBP干預(yù)緩解了急性酒精暴露誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖3 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清TG和TC水平的影響Fig.3 Effects of G.biloba peptides on serum TG and TC levels in acute alcoholic liver injury mice

2.4 對(duì)小鼠血清炎性細(xì)胞因子水平的影響

庫普弗細(xì)胞在酒精性肝損傷的進(jìn)展中扮演著重要的角色，酒精暴露會(huì)刺激庫普弗細(xì)胞通過MyD88介導(dǎo)的Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)通路產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子，而這些促炎細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致脂肪變性，甚至造成肝細(xì)胞炎性損傷和凋亡，加劇急性酒精性肝損傷的進(jìn)展[35-36]。

圖4為GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響。由圖4可知，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平分別是正常組的1.9、2.3和1.9倍，顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷。與模型組相比，GBP組小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；高劑量GBP組小鼠血清TNF-α可恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，提示GBP通過抗炎途徑發(fā)揮其對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。與模型組相比，還原型谷胱甘肽也能顯著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。

圖4 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6和 TNF-α水平的影響Fig.4 Effects of G.biloba peptides on serum IL-1β, IL-6 and TNF-α levels in acute alcoholic liver injury mice

2.5 對(duì)小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

肝臟是機(jī)體內(nèi)酒精生物轉(zhuǎn)化的主要場所，也是酒精毒性作用的主要靶器官。酒精代謝過程中會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，造成機(jī)體氧化與抗氧化防御系統(tǒng)的失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這被認(rèn)為是急性酒精性肝損傷發(fā)生與進(jìn)展的重要機(jī)制之一[37]。CAT、GSH-Px和T-SOD是機(jī)體抗氧化酶促防御系統(tǒng)的主要組分，過量的ROS可作用于CAT、GSH-Px和T-SOD等抗氧化酶，使其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低[38]。

GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性的影響如圖5所示。模型組小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性分別比正常組降低了46.4%、32.8%和28.5%，3種抗氧化酶活性均顯著低于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露致使小鼠肝臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。給藥GBP后，小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量GBP組小鼠GSH-Px和T-SOD活性恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，表明GBP通過提高抗氧化酶活性，發(fā)揮對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。

圖5 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟CAT、GSH-Px和 T-SOD活性的影響Fig.5 Effects of G.biloba peptides on liver CAT, GSH-Px and T-SOD activities in acute alcoholic liver injury mice

2.6 對(duì)小鼠肝臟氧化損傷產(chǎn)物水平的影響

酒精代謝過程中產(chǎn)生的過量ROS可作用于機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子，造成蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，PCG是蛋白質(zhì)氧化損傷的產(chǎn)物，MDA和PCG水平是評(píng)估脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感標(biāo)志物[39-40]。GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和PCG水平的影響如圖6所示。模型組小鼠肝臟MDA和PCG水平顯著高于正常組(P<0.05)，表明酒精攝入造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷。灌胃給藥GBP后，MDA和PCG水平以劑量依賴的方式顯著降低(P<0.05)，提示GBP可緩解酒精暴露誘導(dǎo)的肝組織氧化損傷。

圖6 銀杏肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和 PCG水平的影響Fig.6 Effects of G.biloba peptides on liver MDA and PCG levels in acute alcoholic liver injury mice

3 結(jié)論

GBP對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠具有較好保護(hù)作用，能緩解酒精性肝損傷小鼠的肝脾腫大，降低小鼠血清ALT和AST活性，抑制血清TG和TC水平，下調(diào)血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，提高肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性，降低肝臟MDA和PCG水平。結(jié)果顯示,GBP通過抗氧化和抗炎途徑發(fā)揮其對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，作用機(jī)制與提高機(jī)體抗氧化酶活性和抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。