牛雅倩，李雨桐，趙娟，張琳，盧文明，喬長晟,,5,6*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津，300457) 3(天津慧智百川生物工程有限公司，天津，300457)4(內(nèi)蒙古蒙森農(nóng)業(yè)股份科技有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰，024000) 5(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 6(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水是馬鈴薯淀粉以及相關(guān)淀粉產(chǎn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢液，是一種高濃度的有機(jī)廢水[1]，平均每生產(chǎn)1 t淀粉,需排放20 t左右的廢水，其中需要處理的含蛋白質(zhì)廢水約5 t左右，直接排放不但會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來環(huán)境污染問題[2-4]。馬鈴薯淀粉廢水中含有淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等有機(jī)物[5]，基本沒有毒性，具有高泡沫、高濃度、高濁度的“三高”特點(diǎn)，不能直接排放[6]。

未經(jīng)處理的馬鈴薯淀粉生產(chǎn)廢水會(huì)產(chǎn)生臭味氣體。其中無機(jī)的惡臭污染物有硫化合物、氮化合物等；有機(jī)的惡臭污染物有鏈烴、芳香烴等[7-9]。馬鈴薯蛋白是造成廢水惡臭和氨氮含量超標(biāo)的主要原因，回收馬鈴薯蛋白，不僅可有效降低氨氮含量,減小臭味，同時(shí)有利于降低化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand, COD)和濁度[10]，也有利于廢水的回田灌溉[11]，對(duì)馬鈴薯行業(yè)具有現(xiàn)實(shí)意義。

常見的絮凝劑有機(jī)絮凝劑和無機(jī)絮凝劑。有機(jī)高分子絮凝劑用量少，但不易被生物分解。聚丙烯酰胺會(huì)生成N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物，一種新型的含氮消毒副產(chǎn)物,其潛在的致癌、致畸和致突變性風(fēng)險(xiǎn)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[12-13]。常見的無機(jī)絮凝劑為鋁鹽化合物類以及鐵鹽類絮凝劑。鋁鹽類化合物進(jìn)入人體內(nèi),會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)中毒癥狀,嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致老年癡呆[14]。鐵鹽化合物類絮凝劑會(huì)對(duì)鐵質(zhì)設(shè)備造成嚴(yán)重腐蝕,且具有明顯的顏色變化, 在具體應(yīng)用過程中,具有很大的局限性[14]。而聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)作為一種新型的微生物絮凝劑,具有生物可降解性、水溶性、無毒等特點(diǎn)。采用聚谷氨酸回收馬鈴薯蛋白，過程較為溫和，相較于傳統(tǒng)的無機(jī)絮凝劑，不會(huì)造成重金屬二次污染，具有環(huán)保和經(jīng)濟(jì)的雙重效果[15-16]，在水處理方面具有廣闊的發(fā)展前景[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，內(nèi)蒙古蒙森農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；聚谷氨酸(純度≥90%)，天津慧智百川生物技術(shù)有限公司；CaCl2、K2SO4、CuSO4均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

752紫外可見分光光度計(jì),天津市拓普儀器有限公司；TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；FE20數(shù)顯pH計(jì)，北京匯中順成科技有限責(zé)任公司；SKY-2102搖床，蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；WDP-9062電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海安亭科學(xué)儀器有限公司；GZX-9030MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；JSM-IT300LV掃描電子顯微鏡，無錫東立智能技術(shù)有限公司；IS50傅里葉紅外光譜分析儀，美國尼高力儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚谷氨酸絮凝馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)

馬鈴薯淀粉廢水制備：將馬鈴薯洗凈、切塊，用破碎機(jī)破碎，得到渣水混合物；用80目濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，使渣水分離，自然沉降 24 h，取上清液，即得到馬鈴薯淀粉廢水。準(zhǔn)確量取100 mL馬鈴薯淀粉廢水于250 mL燒杯中，加入聚谷氨酸以及助凝劑CaCl2[18]，并調(diào)節(jié)pH值，以200 r/min的速度用磁力攪拌器攪拌，放入水浴鍋中靜置一段時(shí)間，于5 000 r/min離心10 min，離心沉淀所得即為回收的馬鈴薯蛋白質(zhì)。

1.2.2 蛋白質(zhì)去除率的測(cè)定

馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法。按公式(1)計(jì)算馬鈴薯蛋白去除率：

(1)

式中：m1，回收后的馬鈴薯蛋白，g；m2，馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質(zhì)含量，g；m3，聚谷氨酸中蛋白質(zhì)含量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

探究聚谷氨酸添加量、pH、助凝劑添加量、溫度、絮凝時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，確定了聚谷氨酸添加量、pH值、絮凝溫度為實(shí)驗(yàn)因素。以馬鈴薯粗蛋白去除率為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，各因素水平及編碼值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 馬鈴薯蛋白的紅外光譜分析

將干燥的馬鈴薯蛋白進(jìn)行紅外測(cè)試，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16，采用KBr壓片法：取1 mg完全干燥的馬鈴薯蛋白粉末，并以質(zhì)量比1∶150與干燥的光譜級(jí)KBr粉末一同均勻混合并在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中研磨，完全研細(xì)直至粉末平均粒徑達(dá)到2 μm。再將研好的粉末均勻倒入壓模器中，經(jīng)抽真空處理后，加壓至20 MPa，即得到馬鈴薯蛋白的半透明薄膜。最后將薄片置于樣品架，進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

1.2.6 聚谷氨酸絮體掃描電鏡分析

加入聚谷氨酸以及助凝劑絮凝出馬鈴薯蛋白，烘干后制成薄膜，樣品表面鍍金，用掃描電鏡觀察形態(tài)變化。

1.2.7 廢水檢測(cè)指標(biāo)及方法

pH采用數(shù)顯pH計(jì)；化學(xué)需氧量的測(cè)定采用COD快速測(cè)定儀；氨氮參照 CJ/T 75—1999 納氏試劑比色法測(cè)定?？偭讌⒄誈B 11893—1989鉬酸銨分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Design-expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚谷氨酸添加量對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著聚谷氨酸添加量的增加，由圖1可知，蛋白含量基本呈上升趨勢(shì)。當(dāng)聚谷氨酸添加量為1 g/L時(shí)粗蛋白含量最高，此時(shí)蛋白回收率達(dá)到67.46%。隨著聚谷氨酸添加量的增大，蛋白含量不再增加，呈下降趨勢(shì)。絮凝劑添加過量時(shí)，會(huì)使已經(jīng)形成的絮體重新變成穩(wěn)定的膠體。因此，選擇聚谷氨酸添加量為1 g/L。

圖1 聚谷氨酸添加量對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.1 Effect of polyglutamic acid on flocculation of potato protein content

2.2 pH對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響

由于馬鈴薯廢水偏酸性，故絮凝pH值在酸性區(qū)間選擇。隨著pH值的降低，蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，在pH值為3.5時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高為68.19%；隨著pH值的繼續(xù)下降，蛋白含量也相繼下降，這可能與馬鈴薯貯藏蛋白的等電點(diǎn)有關(guān)， 等電點(diǎn)在pH為3.5附近，蛋白質(zhì)分子顆粒不存在同電的相互排斥作用，極易發(fā)生碰撞，蛋白質(zhì)最容易發(fā)生聚沉[19]。同時(shí)低pH值有利于原水中帶負(fù)電的膠粒發(fā)生電性中和及壓縮雙電層作用，從而減少了膠粒間斥力[20]。因此選擇pH值在3.5為回收馬鈴薯蛋白的最佳pH值。

圖2 pH對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.2 Effect of pH on flocculation of potato protein content

2.3 助凝劑添加量對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響

添加助凝劑不僅有助于降低混凝劑用量還有助于降低混凝過程對(duì)流體力學(xué)條件的依賴性,提高混凝的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)選取CaCl2為助凝劑添加到絮凝過程中。由圖2可知，隨著助凝劑添加量的增加，蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)到66.57%。之后隨著絮凝劑含量的增加，蛋白含量上升趨勢(shì)不明顯。不加入助凝劑時(shí)，蛋白回收率相差較大。因此選擇助凝劑的添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%。

圖3 助凝劑添加量對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.3 Effect of coagulant aid on flocculation of potato protein content

2.4 溫度對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)含量先升高后降低。在溫度為40 ℃時(shí)，蛋白含量最高為67.42%。同時(shí)，絮凝劑的擴(kuò)散速度和顆粒的碰撞速度也隨著溫度的升高而增加；而當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)， 蛋白質(zhì)的去除率隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)槲竭^程是放熱過程，溫度過高不利于絮凝發(fā)生[21]。并且隨著溫度的升高，蛋白會(huì)逐漸變性，不僅顏色會(huì)發(fā)生改變，而且會(huì)降低馬鈴薯蛋白的品質(zhì)，故選擇較溫和的40 ℃為馬鈴薯蛋白含量的最佳絮凝溫度。

圖4 溫度對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.4 Effect of temperature on flocculation of potato protein content

2.5 絮凝時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著絮凝時(shí)間的增加，蛋白含量呈現(xiàn)先升高最終趨于平緩的趨勢(shì)。絮凝體系的形成需要一定的時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，蛋白沉淀逐漸增加，在靜置40 min時(shí)，蛋白質(zhì)含量為68.16%。馬鈴薯蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，呈絮狀沉淀物，此現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用。結(jié)絮作用所形成的絮狀物不穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長，可以再溶于溶液中[22]。因此絮凝效果在35 min時(shí)達(dá)到峰值，隨著絮凝時(shí)間的進(jìn)一步延長，蛋白含量基本保持不變，結(jié)絮后的蛋白質(zhì)可能重新溶于水中導(dǎo)致回收率降低。由圖5可知，隨著時(shí)間的變化，絮凝時(shí)間和其他因素相比，回收率的波動(dòng)較小，因此優(yōu)化時(shí)，不考慮絮凝時(shí)間這一因素。

圖5 絮凝時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.5 Effect of flocculation time on flocculation of potato protein content

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert8.5軟件對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)一共需做17組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

表2 多元回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted response surface mode

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基是否達(dá)到預(yù)期效果，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得結(jié)果取算數(shù)平均值，得到馬鈴薯蛋白去除率為68.43%，與預(yù)測(cè)值較為接近，證明此模型參數(shù)可靠，有參考價(jià)值。使用聚谷氨酸絮凝的馬鈴薯蛋白為灰白色，有利于蛋白的后續(xù)應(yīng)用。在蛋白回收率方面，與酸熱法[23]、堿提酸沉法[24]、無機(jī)絮凝劑法[25]等傳統(tǒng)方法相比，本研究方法回收馬鈴薯蛋白質(zhì)較為理想。

2.8 馬鈴薯蛋白的紅外光譜掃描

2.8.1 聚谷氨酸的絮凝機(jī)理

聚谷氨酸在1 240 cm-1處并沒有吸收峰，而聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品中都在1 240 cm-1有吸收峰，此峰是羧基中C—O的伸縮振動(dòng)所引起的。進(jìn)一步說明了聚谷氨酸在絮凝過程中游離的羧基減少。可能是由于聚谷氨酸中的氨基、羧基分別與馬鈴薯蛋白中的氨基、羧基形成了新的酰胺鍵，發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。

a-加入助凝劑CaCl2聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品；b-未加入助凝劑CaCl2聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品；c-絮凝劑聚谷氨酸純品圖6 聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白的紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum for flocculation of potato protein with polyglutamic acid

2.8.2 助凝劑CaCl2在聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白過程中的作用

(1)加入助凝劑CaCl2后，3 400 cm-1處的吸收峰明顯增強(qiáng)，這個(gè)峰歸屬于締合的氫鍵(仲氨基和羧基之間)的O—H伸縮振動(dòng)。當(dāng)加入Ca2+后，增強(qiáng)了氨基與羧基之間的電離作用力，使締合的氫鍵增強(qiáng)，由于氫鍵的作用力增強(qiáng)，聚谷氨酸氫鍵和Ca2+之間的靜電作用力也隨之增強(qiáng)。

(3)加入助凝劑CaCl2后，1 315 cm-1的吸收峰發(fā)生藍(lán)移至1 330 cm-1。1 330 cm-1為脂肪族仲胺中C—N的伸縮振動(dòng)峰。加入Ca2+后，仲胺中C—N上的電子云更集中，C—N鍵增強(qiáng)，增強(qiáng)了聚谷氨酸的負(fù)電性或帶電能力，所以聚谷氨酸的靜電力提升。

上述幾個(gè)化學(xué)鍵的變化表明，CaCl2的加入，提升了聚谷氨酸的靜電能力，使得聚谷氨酸的絮凝作用增強(qiáng)。掃描電鏡的結(jié)果顯示，聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白過程中加入助凝劑CaCl2，主要由于橋聯(lián)作用提高了絮凝效率。

2.9 掃描電子顯微鏡分析

γ-PGA分子結(jié)構(gòu)中有大量的游離羧基，具有-COO-反應(yīng)活性基團(tuán)，對(duì)陽離子具有一定的絡(luò)合能力。帶正電的離子會(huì)與γ-PGA的游離羧基結(jié)合從而改變?chǔ)?PGA的帶電性，進(jìn)一步改變?chǔ)?PGA分子間的作用力，因此加入Ca2+， γ-PGA便凝聚成絮團(tuán)狀集合體而發(fā)生聚沉[26]。

由圖7-a和圖7-b可以看出，由于在絮凝過程中，聚谷氨酸與馬鈴薯淀粉廢水中懸浮物顆粒在吸附架橋和電中和壓縮雙電層的機(jī)理作用下[26]，形成的絮體呈立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；同時(shí)由于生物大分子的振動(dòng)收縮，在絮體沉降過程中，不斷將分散在馬鈴薯淀粉廢水中蛋白顆粒網(wǎng)捕和卷入絮體中[26]，而與絮體一同沉淀下來。絮凝過程中的絮體電鏡掃描圖圖7-c以及圖7-d反映了這一機(jī)理,即網(wǎng)捕卷掃機(jī)理。紅外圖譜的結(jié)論與掃描電鏡的結(jié)論吻合。

圖7 聚谷氨酸絮體掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope of flocs of polyglutamic acid

2.10 馬鈴薯廢水處理前后相關(guān)指標(biāo)變化

使用聚谷氨酸去除馬鈴薯淀粉廢水中的馬鈴薯蛋白后，馬鈴薯蛋白含量為65%，馬鈴薯淀粉廢水的指標(biāo)變化如表3所示。使用聚谷氨酸處理后的馬鈴薯淀粉廢水，氨氮、總磷以及COD以及懸浮物(suspended substance, SS)值都降低。一方面，從工業(yè)廢水處理的角度看，氨氮、總磷以及COD的降低有利于馬鈴薯廢水的后續(xù)處理，可以考慮使用生物處理法進(jìn)一步處理回收蛋白后的馬鈴薯淀粉廢水，實(shí)現(xiàn)廢水的資源化利用。另一方面，從肥料應(yīng)用的方面看，利用其中的氮元素以及磷元素等，以馬鈴薯廢水作為水溶性肥原料進(jìn)行下一步研究。

表3 馬鈴薯淀粉廢水的指標(biāo)變化Table 3 Index changes of potato starch wastewater

3 結(jié)論

本研究利用新型微生物絮凝劑聚谷氨酸去除馬鈴薯蛋白，通過單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出：聚谷氨酸添加量0.93 g/L、初始pH值為3.23，絮凝溫度40 ℃、靜置時(shí)間為40 min，此條件下馬鈴薯蛋白去除率為68.43%。通過傅里葉紅外光譜分析表明，聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白可能是聚谷氨酸中的氨基、羧基分別與馬鈴薯蛋白中的氨基、羧基形成了新的酰胺鍵，發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。通過掃描電子顯微鏡分析表明，馬鈴薯蛋白通過網(wǎng)捕卷掃機(jī)理進(jìn)入聚谷氨酸以及助凝劑形成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。測(cè)定回收蛋白前后馬鈴薯淀粉廢水的相關(guān)指標(biāo)值，氨氮去除率為40.62%、總磷去除率為42.66%、COD去除率為34.80%。此方法提取出的馬鈴薯蛋白，相比于無機(jī)絮凝劑，不會(huì)造成金屬元素的超標(biāo)，并且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，可以循環(huán)利用，如蛋白肥料的應(yīng)用。本研究為馬鈴薯淀粉廢水的處理提供了新的思路與方法，有利于實(shí)現(xiàn)馬鈴薯廢水的資源化利用。在水處理方面應(yīng)用前景廣闊，具有可行性。