樊嘉訓(xùn)，劉松,2，陸信曜，陳堅(jiān)*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

醬油是一種受歡迎的東方發(fā)酵調(diào)味品，由豆粕、麩皮與米曲霉、酵母菌和乳酸菌混合，經(jīng)過(guò)制曲(固態(tài)發(fā)酵)和醬醪(鹽水發(fā)酵)兩步發(fā)酵而成[1]。醬油生產(chǎn)過(guò)程中，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶不僅可以分解原料，決定醬油的氨基酸態(tài)氮含量，而且通過(guò)降解原料蛋白釋放出氨基酸或多肽，改善醬油的風(fēng)味、色澤和口感。因此，蛋白酶的酶活力高低是米曲霉菌種的衡量指標(biāo)。蛋白酶活性的高低決定了蛋白質(zhì)的利用率，高酶活力不僅可以更好地分解原料，提升醬油的氨基酸態(tài)氮含量，進(jìn)而決定了最終產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤和口感[2]。目前，獲得高蛋白酶活性菌株以提高原料氮利用率的育種技術(shù)[3]主要包括物理化學(xué)誘變[4]和原生質(zhì)體融合技術(shù)[5]等。與傳統(tǒng)的誘變方法相比，近年來(lái)興起的常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma, ARTP)誘變對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，獲得突變型的多樣性可能性增大，且操作簡(jiǎn)單安全[6]，廣泛應(yīng)用于絲狀菌的育種。

在絲狀菌的誘變后初篩中，傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)技術(shù)存在通量低、耗時(shí)多、勞動(dòng)強(qiáng)度大且商業(yè)生產(chǎn)成本高的弊端。因此，構(gòu)建一種高效、快速、高通量的篩選方法來(lái)獲得目標(biāo)菌株有助于縮減絲狀菌的育種周期。流式細(xì)胞術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、客觀的技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)粒子的多種特征，識(shí)別細(xì)胞或顆粒所攜帶的熒光染料，并對(duì)特定群體進(jìn)行分選[7]。本研究通過(guò)ARTP和基于碘化丙啶和熒光素二乙酸酯雙染色的流式分選初篩獲得了1株高酶活力的米曲霉突變株，并對(duì)其在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行模擬分析，以期為絲狀菌的高通量誘變育種和醬油現(xiàn)代釀造品質(zhì)的提升提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑

菌株：米曲霉(Aspergillusoryzae)滬釀3.042，紹興至味食品有限公司。

主要試劑：熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate, FDA)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、福林酚試劑、干酪素等。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

PD培養(yǎng)基(g/L)：新鮮去皮土豆(去離子水煮沸30 min) 200，葡萄糖20，K2HPO43，MgSO4·7H2O 1.5。固體培養(yǎng)基在以上基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白酶6，K2HPO40.56，NaH2PO4·2H2O 0.75，Na2HPO40.75。

種曲培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：80%麩皮，20%面粉，向上述固體中加水至含水量80%～85%，分裝入250 mL三角瓶，1 cm厚。

48深孔板液態(tài)培養(yǎng)基(g/L)：麩皮浸提液64，面粉浸提液16， (NH4)2HPO416, K2HPO40.32， MgSO4·7H2O 0.16。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ARTP誘變文庫(kù)的構(gòu)建

培養(yǎng)成熟后的米曲霉用無(wú)菌水洗滌，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后獲得孢子懸液，離心后洗滌、懸浮備用。ARTP誘變中，誘變條件設(shè)為：通氣量10 SLM、功率100 W、時(shí)間分別設(shè)為0、20、40、60、80、100、120 s。誘變處理后的載片于PBS中洗脫，將洗脫液稀釋不同倍數(shù)后涂布，0 s計(jì)數(shù)為A，其他時(shí)刻計(jì)數(shù)為B[8]。致死率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A，誘變后存活孢子數(shù)；B，誘變前總孢子數(shù)。

將誘變后的樣品放入含有無(wú)菌等離子水的新試管中懸浮備用。

1.2.2 基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選

FDA單染：將不同體積的FDA染料與不同質(zhì)量濃度的孢子懸浮液混合，使每個(gè)樣品的最終質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL，室溫下暗箱孵育5、10、15、20 min后涂布平板，計(jì)算致死率[9]。

PI單染：將不同體積的PI染料與不同質(zhì)量濃度的孢子懸浮液混合，使每個(gè)樣品的最終質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9 μg/mL，4 ℃暗箱孵育5、10、15、20 min后涂布平板，計(jì)算致死率[10]。

將處理好的樣品上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。沒(méi)有經(jīng)過(guò)染色的樣品設(shè)置為陰性對(duì)照，與FDA染料結(jié)合的活性樣品發(fā)綠熒光由FITC-Log通道檢測(cè)，與PI染料結(jié)合的無(wú)活性樣品發(fā)紅熒光由RPE-TR-Log通道檢測(cè)。以單細(xì)胞模式將單個(gè)活性孢子分選入48孔板發(fā)酵培養(yǎng)基中，而后于30 ℃，220 r/min在多孔板搖床上發(fā)酵，24 h后系統(tǒng)地轉(zhuǎn)移至48深孔板中，在高速振蕩培養(yǎng)箱中相同發(fā)酵條件下繼續(xù)發(fā)酵48 h。然后采用高通量移液技術(shù)將發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)48深孔板里進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)定。最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板上，于660 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。至此，基于以上實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建了一套完整的篩選高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株的方法，如圖1所示。

圖1 高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株的篩選流程Fig.1 Screening process of Aspergillus oryzae with high-productive proteaso

1.2.3 種曲胞外蛋白分析

固態(tài)培養(yǎng)基中胞外蛋白的提取遵循ODA等[11]的方法。將提取出的蛋白沉淀在室溫下溶于1×NuPAGE LDS樣品緩沖液中1 h以上，得到蛋白質(zhì)溶液。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的濃度，調(diào)整樣品濃度至相同，最終確定每泳道的上樣量為10 μL，凝膠電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色。

將需要鑒定的條帶切成約1 mm大小的膠粒于離心管中，加入測(cè)序級(jí)胰蛋白酶溶液于37 ℃反應(yīng)過(guò)夜，吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新離心管。原管加入100 μL 0.1%三氟乙酸溶液，超聲15 min后合并酶解液并凍干。此時(shí)樣品制備完成，加3 μL 0.1%三氟乙酸溶液復(fù)溶，點(diǎn)樣，進(jìn)行質(zhì)譜分析[10]。

串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀型號(hào)為AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF，激光源為349 nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓為2 kV，采集數(shù)據(jù)模式為正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式。用Mascot 2.2軟件對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的原始文件進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，最終確定了蛋白鑒定結(jié)果。

1.2.4 RNA收集、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用布氏漏斗抽濾收集發(fā)酵液中的菌體，無(wú)菌水洗滌菌體2次后提取總RNA。將收集的菌體于液氮中研磨至白色細(xì)膩粉末狀，按照植物RNA提取試劑盒方法提取目標(biāo)RNA。提取完的 RNA 使用 Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)在 260 nm/280 nm 條件下進(jìn)行定量。使用 DNA 酶處理所有的總 RNA 樣品，以去除殘留的基因組 DNA。

使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time試劑盒法將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鑒定結(jié)果，在NCBI上查詢米曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因序列、pepA(aspergillopepsin-1)基因序列、ALP(alkaline protease，partial)基因序列和AO090001000135(neutral protease 2 homolog AO090001000135)基因序列。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒法配制反應(yīng)體系并在StepOnePlus實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。以米曲霉GAPDH基因作為參比基因，所用引物如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 所用引物Table 1 Primers for RT-qpcr

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室醬油模擬發(fā)酵工藝

制曲工藝：將豆粕與麩皮按4∶1的體積比混合均勻，121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫。接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%，濃度107CFU/mL的米曲霉孢子懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)，保持濕度，適時(shí)翻曲直至曲料表面長(zhǎng)滿黃綠色菌絲即可[12]。

發(fā)酵工藝：成曲按照1∶1.7的質(zhì)量比加入13 °Bé、50 ℃的鹽水于40 ℃發(fā)酵25 d[13]。工藝流程如圖2所示。

圖2 醬油模擬工藝Fig.2 Simulation producing technology of soy sauce

醬醪理化指標(biāo)的測(cè)定：在第5、10、15、20、25 天進(jìn)行取樣。醬醪樣品于12 000 r/min離心后取上清液并經(jīng)孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾。氨基酸態(tài)氮的含量測(cè)定采用甲醛滴定法[14]，總氮的測(cè)定采用凱氏定氮法[15]，游離氨基酸的測(cè)定采用高效液相法[16]，有機(jī)酸的測(cè)定采用高效液相色譜法[17]，揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定采用固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變及高通量篩選

控制誘變時(shí)間為唯一變量，獲得致死率與誘變時(shí)間的關(guān)系曲線(圖3-a)。隨機(jī)挑取一定數(shù)量的單菌落于48深孔板發(fā)酵，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵48 h后蛋白酶酶活力，獲得正突變率與致死率的關(guān)系。如圖3-b所示，孢子的致死率與誘變時(shí)間呈正相關(guān)，正突變率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，考慮到高致死率有利于縮小突變庫(kù)，故誘變條件確定為：通氣量10 SLM、功率100 W、時(shí)間100 s。

FDA通過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜，被細(xì)胞中的非特異性酯酶分解產(chǎn)生熒光素并積蓄在活細(xì)胞中產(chǎn)生熒光[19]。PI可以透過(guò)死細(xì)胞的細(xì)胞膜使細(xì)胞核紅染[20]。根據(jù)2種染料的特性將誘變后的活孢子與死孢子區(qū)分開(kāi)來(lái)。通常染料濃度越高、染色時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越明顯。然而，相應(yīng)地，染料對(duì)細(xì)胞的致死作用也越嚴(yán)重。所以考察了2種染料的毒性以及染色時(shí)間對(duì)米曲霉孢子的影響。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為100 μg/mL FDA在室溫下染色20 min，PI質(zhì)量濃度為6 μg/mL在4 ℃下染色10 min效果最佳，當(dāng)致死率低于10%時(shí)，染色效果與染料濃度和染色時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系(表2)。

a-致死率；b-正突變率圖3 ARTP誘變的致死率和正突變率Fig.3 Lethality rate and positive mutation rate of ARTP mutagenesis

根據(jù)優(yōu)化后的最優(yōu)染色條件，對(duì)誘變后的樣品進(jìn)行FDA-PI雙熒光復(fù)染，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。建立雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸，將沒(méi)有進(jìn)行染色操作的孢子懸液作為陰性對(duì)照(圖4-a)；活孢子經(jīng)FDA單染后，主要集中于FDA+區(qū)域(圖4-b)；死孢子經(jīng)PI單染后，主要集中于PI+區(qū)域(圖4-c)；樣品經(jīng)FDA-PI雙染后，死活孢子各自分布于PI+區(qū)域和FDA+區(qū)域(圖4-d)。

表2 染料的濃度和染色時(shí)間對(duì)孢子的致死率單位：%

經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，借助高通量孔板培養(yǎng)、酶標(biāo)儀檢測(cè)器等高通量設(shè)備，構(gòu)建好初篩方法，測(cè)定孔板內(nèi)蛋白酶反應(yīng)液的OD值(圖5-a)。經(jīng)過(guò)4輪誘變，總共獲得4 032株突變菌株，初篩選出16株產(chǎn)量較高的菌株。如圖5-b所示，將初篩得到的高產(chǎn)的16株突變菌株和出發(fā)菌株制曲72 h的中性蛋白酶活性進(jìn)行再測(cè)試，突變菌株H34的中性蛋白酶活性達(dá)到3 684.3 U/g，較出發(fā)菌株的酶活力提高了145.6%。為了驗(yàn)證突變株H34傳代過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性，將該菌株定期傳代7次，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，突變株H34蛋白酶活性波動(dòng)較小且穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性較好(圖5-c)。

a-對(duì)照；b-FDA單染；c-PI單染；d-FDA-PI雙染圖4 熒光染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析Fig.4 Sorting based on flow cytometry

a-初篩結(jié)果;b-復(fù)篩結(jié)果;c-遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果圖5 篩選結(jié)果Fig.5 Screening results

2.2 種曲胞外蛋白鑒定與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析

通過(guò)SDS-PAGE，獲得了米曲霉3.042和高產(chǎn)菌株H34在制曲條件下的胞外蛋白譜(圖6-a)。選取蛋白含量相差明顯的條帶(條帶1、2和3)，對(duì)其進(jìn)行MALDI-TOF/TOF比對(duì)分析。其中條帶1被鑒定為酸性蛋白酶(aspergillopepsin-1)，條帶2被鑒定為堿性蛋白酶(alkaline protease，partial)，條帶3被鑒定為中性蛋白酶(neutral protease 2 homolog AO090001000135)。Aspergillopepsin-1，原名Aspergillus peptidase A，是從用于發(fā)酵日本傳統(tǒng)清酒和燒酒的微生物中分離出來(lái)的[20]。由alp基因編碼的堿性蛋白酶對(duì)醬油的品質(zhì)至關(guān)重要，它的主要作用是水解大豆蛋白產(chǎn)生大量的多肽[21]，中性蛋白酶是米曲霉分泌的一種重要蛋白酶。醬油企業(yè)常用中性蛋白酶的活性作為判斷醬油曲品質(zhì)的指標(biāo)之一[13]。

如圖6-b，高產(chǎn)蛋白酶菌株H34中ALP、pepA和AO090001000135的基因轉(zhuǎn)錄水平分別高于原始菌株米曲霉45%、233%、256%。說(shuō)明ALP、pepA和AO090001000135基因轉(zhuǎn)錄水平的提高是引起種曲發(fā)酵酶活力提高的主要因素。ARTP處理可能加強(qiáng)了米曲霉ALP、pepA和AO090001000135基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高了蛋白酶的酶活力。

a-種曲胞外鑒定結(jié)果；b-基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析圖6 種曲胞外蛋白鑒定與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析Fig.6 Extracellular protein profiles and gene expression levels of two strains

2.3 兩株米曲霉產(chǎn)醬油風(fēng)味物質(zhì)和理化指標(biāo)的比較分析

氨基酸態(tài)氮和總氮2個(gè)指標(biāo)越高，代表醬油中氨基酸的含量豐富，口感鮮美。2個(gè)發(fā)酵組醬醪中全氮的變化情況如圖7-a所示，誘變菌株H34在發(fā)酵終點(diǎn)較出發(fā)菌株全氮的質(zhì)量濃度提高了6%，總氮利用率較出發(fā)菌株提高了8.4%，在經(jīng)濟(jì)性方面應(yīng)用誘變菌株H34將減少原料消耗并增加企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。如圖7-b所示，2組醬醪中氨基酸態(tài)氮前期積累程度相似，但后期菌株H34的積累量緩慢升高，發(fā)酵終點(diǎn)較出發(fā)菌株3.042約提高了6.8%。

a-總氮;b-氨基酸態(tài)氮圖7 醬醪發(fā)酵階段總氮和氨基酸態(tài)氮變化情況Fig.7 Changes of total nitrogen and amino acid nitrogen during moromi period

游離氨基酸對(duì)以蛋白為主要發(fā)酵基質(zhì)的大豆發(fā)酵食品獨(dú)特滋味和香氣的形成具有重要作用[22]，不同的氨基酸可以提供不同的口味[23]。如圖8所示，誘變菌株H34發(fā)酵醬油中鮮味、甜味、苦味氨基酸總量相對(duì)有所增加，但總體上呈味氨基酸并沒(méi)有太大變化。由此推測(cè)，米曲霉H34所分泌的蛋白酶更加具有優(yōu)勢(shì)且釀造出的醬油在呈味方面沒(méi)有太大變化，可以投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中。

a-鮮味氨基酸;b-甜味氨基酸;c-苦味氨基酸;d-有機(jī)酸圖8 醬油樣品中呈味氨基酸含量和有機(jī)酸含量Fig.8 Content of flavor amino acids and organic acids in soy sauce samples

利用HPLC法對(duì)2個(gè)發(fā)酵組進(jìn)行有機(jī)酸檢測(cè)分析，結(jié)果如圖8-d所示。發(fā)酵終期H34較出發(fā)菌株產(chǎn)醬油中酒石酸、甲酸、乳酸、丙酸含量均增高。且乳酸作為脂類物質(zhì)前體，乳酸的增多也導(dǎo)致了脂類香氣物質(zhì)的增多[24]。酒石酸主要是食品中酸味成分的主要來(lái)源，構(gòu)成了食品中的酸性口味[25]。

通過(guò)SPME-GC-MS分析方法共檢測(cè)出49種揮發(fā)性化合物(表3)，米曲霉H34發(fā)酵的醬油中，醇、酮、醛、酯類物質(zhì)成分含量均有所提高。醇類主要是在酵母作用下生成，有機(jī)酸與醇類作為脂類物質(zhì)的前體，其含量增多又相應(yīng)地帶動(dòng)了脂類物質(zhì)含量的提高[26]。酯類物質(zhì)具有香味清、散逸快、遠(yuǎn)、突出的特點(diǎn)；醇類物質(zhì)是醇香和助香劑的來(lái)源，是構(gòu)成脂類物質(zhì)的前提；醛類通常具有刺激性氣味，適當(dāng)含量的醛類物質(zhì)具有調(diào)和香氣的作用，并且能與醇類物質(zhì)反應(yīng)，形成一系列復(fù)雜的風(fēng)味化合物使醬油風(fēng)味更加豐富[27]。

表3 醬醪中的揮發(fā)性物質(zhì)成分分析 單位：μg/mL

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株的方法，以提高米曲霉分泌中性蛋白酶的酶活力，進(jìn)而提高釀造醬油的全氮利用率和蛋白質(zhì)利用率，改善最終產(chǎn)品的風(fēng)味、口感。米曲霉的傳統(tǒng)篩選方法受限于自身單個(gè)菌落直徑較大的問(wèn)題，從而分選通量極小，且對(duì)人力的依賴性很強(qiáng)，本研究中流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用使單次通量提高了11倍。

與米曲霉3.042相比，通過(guò)誘變育種高通量篩選所篩選的H34菌株使中性蛋白酶的活性增加了2倍以上，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶的分泌也相應(yīng)增加。重要的是，具有優(yōu)良蛋白酶活性的菌株，可以在醬油釀造過(guò)程中一定程度上提高原料的蛋白質(zhì)利用率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室醬油模擬釀造實(shí)驗(yàn)，對(duì)米曲霉H34和3.042產(chǎn)醬油的理化指標(biāo)、氨基酸、有機(jī)酸、揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定和比較分析，確定了米曲霉H34在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。研究結(jié)果為改進(jìn)傳統(tǒng)醬油技術(shù)和促進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了參考，也對(duì)流式細(xì)胞術(shù)在絲狀真菌選育中的應(yīng)用具有指導(dǎo)和借鑒作用。