劉逍遙,范瓊尹,高 健,蘇澤琦,3,張晶璇,趙保勝,朱佩軒,王 停,3*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院,北京 100029;3.國家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)名方重點研究室,北京 100029)

黃褐斑是一種獲得性黑色素沉著性皮膚病,常見于中青年女性,以面部淡褐色至深褐色界限清楚的斑片為主要臨床表現(xiàn)[1]。 因其多發(fā)于面部,嚴(yán)重影響患者容貌、心理和社交,已經(jīng)成為女性身心健康的一大殺手[2]。 黃褐斑病因病機復(fù)雜,確切發(fā)病機制尚不清楚,且其臨床研究有一定的局限性,因此通過模擬臨床發(fā)病過程而建立黃褐斑動物模型是研究黃褐斑疾病的重要方法之一。

目前認(rèn)為,黃褐斑可能與紫外線輻射、口服避孕藥以及女性性激素水平變化等因素有關(guān)[3-5],根據(jù)“雌激素和黃體酮增多進(jìn)而刺激黑色素細(xì)胞而致色素沉著”的發(fā)病假說以及“日光照射是黃褐斑發(fā)生發(fā)展的重要因素”等[6],常采用紫外線照射、肌內(nèi)注射黃體酮注射液以及紫外線照射聯(lián)合肌內(nèi)注射黃體酮注射液的方法建立黃褐斑動物模型。 但在黃體酮注射劑量、紫外線照射參數(shù)以及動物品系的選擇等方面尚存在一定的爭議,使目前建立的動物模型方法種類較多,尚未建立統(tǒng)一的模型制備方法。 因此,本文通過采用肌內(nèi)注射不同劑量黃體酮的方法建立SD 大鼠和KM 小鼠黃褐斑模型,以及通過紫外線照射和紫外線照射聯(lián)合黃體酮的方法建立C57BL/6 小鼠黃褐斑模型,綜合探討造模方法、黃體酮注射劑量以及動物品種等因素對黃褐斑成模的影響,以期為研究黃褐斑的發(fā)病機制以及黃褐斑動物模型建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雌性 SD 大鼠 20 只,SPF 級,體重(200±20)g,健康雌性 KM 小鼠 15 只,SPF 級,體重(20±2)g,均由北京維通利華生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0011][SCXK(京)2016-0006];健康雌性C57BL/6 小鼠9 只,SPF 級,六周齡,體重(16~18)g,由北京斯貝福實驗動物有限公司提供[SCXK(京)2019-0010]。 所有動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物飼養(yǎng)室[SYXK(京)2016-0038],室內(nèi)溫度20℃~25℃,相對濕度40%~60%,光照周期明暗各12 h,動物飼養(yǎng)期間可自由攝食和飲水,實驗方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查(BUCM-2019081901-3056),并按照實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

脫毛膏(廣州宏萊生物科技有限公司,國妝特字G20160106);10%福爾馬林中性組織固定液(南昌雨露實驗器材有限公司,中國);電動寵物剃毛器(寧波神劍電器制造有限公司);黃體酮注射液(浙江仙琚制藥有限公司,批號:181210);蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號:20200508);Masson-Fontana 黑色素染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司,貨號:DJ0021-3*50ML);生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司, 批號 1902180724); 多功能電子天平(BSA323S,德國 Satorius 公司);分體式包埋機(EG1150,德國Leica 公司);半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2245,德國Leica 公司);病理圖像采集系統(tǒng)(BX53-DP26,日本OLYMPUS 公司);光學(xué)顯微鏡(OlyPus BX4,中國上海賴氏電子科技有限公司);窄譜311 紫外線光療儀(SH1B,上海希格瑪高技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃體酮注射劑量、動物品種對黃褐斑動物模型的影響

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,將20 只SD 大鼠按照體重隨機分為4 組:正常組以及黃體酮高、中、低劑量造模組,每組5 只;15 只KM 小鼠按體重隨機分為3 組:正常組以及黃體酮高、低劑量造模組,每組5 只。 于實驗前24 h 將所有動物脊柱兩側(cè)及靠臀部皮膚用剃毛器脫毛后,用溫和型脫毛膏脫毛,脫毛面積2 cm×2 cm。 脫毛后背部皮膚光潔正常、沒有刺激性,之后每周脫毛1 次,以免影響觀察。

SD 大鼠實驗中黃體酮高、中、低劑量造模組分別在SD 大鼠后肢根部肌內(nèi)注射黃體酮注射液25 mg/kg、15 mg/kg、7.5 mg/kg,每日一次,兩后肢交替注射,連續(xù)注射30 d,正常組注射與高劑量黃體酮造模組等體積的生理鹽水。 KM 小鼠實驗中黃體酮高、低劑量造模組分別在KM 小鼠后肢根部肌內(nèi)注射黃體酮注射液30 mg/kg 、20 mg/kg,每日一次,兩后肢交替,連續(xù)30 d,正常組注射與黃體酮高劑量造模組等體積的生理鹽水。 實驗動物分組及造模劑量見表1。

表1 SD 大鼠、KM 小鼠實驗動物分組與給藥劑量表Table 1 Grouping and dosing scales of SD rats and KM mice

1.3.2 造模方法對黃褐斑動物模型的影響

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,將9 只 C57BL/6 小鼠按照體重隨機分為正常組、紫外線造模組以及紫外線聯(lián)合黃體酮造模組,每組3 只。 紫外線造模組與紫外線照射聯(lián)合黃體酮造模組于實驗第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 天下午 15 ∶00-17 ∶00 用紫外線光療儀照射30 s,紫外線燈管距脫毛后的皮膚表面約為2 cm,紫外燈管輻照面積為11×2 cm2,正常組不做紫外干預(yù)。 照射紫外線30 min 前,紫外線聯(lián)合黃體酮造模組在小鼠后肢根部肌內(nèi)注射20 mg/kg 的黃體酮注射液,紫外線造模組和正常組注射等體積生理鹽水,每天一次,共21 d。 實驗分組、黃體酮注射劑量以及紫外線照射劑量見表2,紫外線照射時間安排見圖1。

圖1 紫外線照射及黃體酮注射時間安排Figure 1 Schedule of UVB exposure and progesterone injection

表2 C57BL/6 小鼠實驗動物分組及造模安排表Table 2 Grouping and modeling schedule of C57BL/6 mice

1.3.3 皮膚組織病理學(xué)觀察

實驗第22 天,C57BL/6 小鼠取血后,取耳部、背部新鮮皮膚組織(1.0 cm×1.0 cm),放入10%中性福爾馬林固定24 h 后,脫水,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)3 μm 厚切片兩張,一張用于 HE 染色,另一張用于Masson-Fontana 特殊染色,中性樹膠封片后,光學(xué)顯微鏡下觀察,并以40×的最終放大倍數(shù)對切片進(jìn)行拍照;實驗第31 天SD 大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血、KM 小鼠取血,處死動物后取背部新鮮皮膚組織(1.0 cm×1.0 cm),用同樣的方法進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 黃體酮注射劑量、動物品種對黃褐斑動物模型背部皮膚組織HE 染色結(jié)果的影響

HE 染色條件下,黑色素細(xì)胞多呈棕黃色或棕褐色。 造模后SD 大鼠、KM 小鼠背部皮膚組織HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,正常組和黃體酮各劑量造模組背部皮膚表皮基底層均未觀察到明顯的黑色素顆粒,見圖2。

圖2 SD 大鼠、KM 小鼠背部皮膚組織HE 染色結(jié)果Note. A-D, Normal group, high, medium and low dose progesterone model group in the SD rats. E-G, Normal group , the high-dose andlow-dose progesterone model group in the KM mice.Figure 2 Results of HE staining of dorsal skin tissues of SD rats and KM mice

2.2 黃體酮注射劑量、動物品種對黃褐斑動物模型背部皮膚組織Masson-Fontana 染色結(jié)果的影響

Masson-Fontana 黑色素染色下,黑色素顆粒呈黑色。 造模后SD 大鼠、KM 小鼠背部皮膚組織進(jìn)行Masson-Fontana 黑色素染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,正常組和黃體酮高劑量造模組背部皮膚表皮基底層均未觀察到明顯的黑色素顆粒,結(jié)果見圖3。

圖3 SD 大鼠、KM 小鼠背部皮膚組織Masson-Fontana 染色結(jié)果Note. A, Normal group in the SD rats. B, High-dose progesterone modeling group in the SD rats. C, Normal group in the KM mice. D,High-dose progesterone modeling group in the KM mice.Figure 3 Results of Masson-Fontana staining of dorsal skin tissues of SD rats and KM mice

2.3 造模方法對黃褐斑動物模型皮膚組織HE 染色結(jié)果的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察C57BL/6 小鼠耳部、背部皮膚組織HE 染色結(jié)果,造模后正常組背部皮膚表皮基底層可觀察到散在分布的黑色素顆粒,紫外線聯(lián)合黃體酮造模組和紫外線組背部皮膚表皮基底層黑色素顆粒較正常組明顯增多;造模后正常組耳部皮膚組織表皮基底層可觀察到散在分布的黑色素顆粒,紫外線聯(lián)合黃體酮造模組和紫外線造模組可觀察到明顯的黑色素顆粒,HE 染色結(jié)果見圖4。

圖4 C57BL/6 小鼠背部、耳部皮膚組織HE 染色結(jié)果Note. A-C, Results of HE staining of skin tissues on the back of the normal group, UV combined progesterone modeling group and UV modeling group, respectively. D-F,Results of HE staining of skin tissues on the ears of the normal group,UV combined progesterone modeling group and UV modeling group, respectively, with melanin particles shown as arrows in the figure.Figure 4 HE staining results of skin tissue on the back and ear of C57BL/6 mice

2.4 造模方法對黃褐斑動物模型皮膚組織Masson-Fontana 染色結(jié)果的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察C57BL/6 小鼠耳部、背部皮膚組織Masson-Fontana 染色結(jié)果,造模后正常組背部皮膚表皮基底層可以觀察到極少數(shù)量的黑色素顆粒,紫外線聯(lián)合黃體酮造模組和紫外線組背部皮膚表皮基底層黑色素顆粒較正常組明顯增多;造模后正常組耳部皮膚組織表皮基底層可以觀察到散在分布的黑色素顆粒,紫外線聯(lián)合黃體酮造模組和紫外線造模組可以觀察到明顯的黑色素顆粒,Masson-Fontana 染色結(jié)果見圖5。

圖5 C57BL/6 小鼠背部、耳部皮膚組織Masson-Fontana 染色結(jié)果Note. A-C, Results of Masson-Fontana staining of skin tissues on the back of the normal group, UV combined progesterone modeling group and UV modeling group, respectively. D-F, Results of Masson-Fontana staining of skin tissues on the ears of the normal group, UV combined progesterone modeling group and UV modeling group, respectively, with melanin particles shown as arrows in the figure.Figure 5 Masson-Fontana staining results of skin tissue on the back and ear of C57BL/6 mice

3 討論

黑色素是由皮膚組織表皮基底層黑色素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酶以及酪氨酸酶相關(guān)蛋白的催化作用下形成的一種生物色素,是決定皮膚顏色的主要因素,在抵御紫外線等有害刺激中起著重要的防御作用,但當(dāng)黑色素生成過多或黑色素的代謝出現(xiàn)異常時,過多的黑色素由黑色素細(xì)胞向上遷移,最終積累在皮膚表面,造成肉眼可見的黑色素,黃褐斑便是一種因皮膚中黑色素異常累積形成的疾病[7]。

目前,國內(nèi)學(xué)者在建立黃褐斑動物模型時多選擇KM 小鼠和SD 大鼠等動物品種[8],在造模方法上,多根據(jù)其與紫外線輻射、內(nèi)分泌等因素有關(guān)而采用紫外線照射、肌注黃體酮注射液等方法模擬疾病臨床發(fā)病因素進(jìn)行造模;而國外學(xué)者多采用C57BL/6 小鼠、HRM-2 無毛鼠等動物品系,在造模方法上多使用紫外線照射[9]。 有文獻(xiàn)報道,紫外線照射和黃體酮攻擊的方法均可以成功建立黃褐斑動物模型[10],日光中的紫外線作為一種外源性刺激,能氧化破壞皮膚中的巰基(-SH)而提高酪氨酸酶的活性,酪氨酸酶在刺激黑色素細(xì)胞的分裂,增加單位面積內(nèi)黑色素細(xì)胞數(shù)量的同時,也會促使黑色素細(xì)胞中黑素小體的分泌和移動擴散,最終引起皮膚色素沉著[11-12];黃體酮可通過增加黑色素細(xì)胞數(shù)量和黑色素合成過程中關(guān)鍵酶的活性來增加黑色素[13]。 從造模原理上來看,紫外線能從病因和癥狀兩個方面模擬黃褐斑的發(fā)病,黃體酮能夠從病因角度模擬黃褐斑的發(fā)病,而紫外線聯(lián)合黃體酮的方法在模擬太陽光照射的同時又增加了激素的影響,模擬了黃褐斑臨床發(fā)病的多因性。 關(guān)于黃褐斑動物模型的制備,我國雖出臺了相應(yīng)的草案[6],但因草案中未明確指出動物的品系、紫外線的輻照強度等模型制備中的關(guān)鍵因素,對相關(guān)科研工作者帶來了困擾,一定程度上影響了模型的復(fù)制,所以本研究通過復(fù)制國內(nèi)外常見的幾種模型,以期探索一種符合黃褐斑臨床疾病特點的模型制備方法。

在黃褐斑動物模型的評價上,目前尚缺少公認(rèn)的評價標(biāo)準(zhǔn)。 因黃褐斑臨床以面部斑塊為主要表現(xiàn),所以從表觀指標(biāo)上觀察到局部皮膚的明顯斑塊是評價黃褐斑動物模型成功與否的重要指標(biāo),但因表觀指標(biāo)帶有一定的主觀性,且會受到燈光、像素以及動物皮膚表面污染等外界因素的干擾,在一定程度上限制了其的應(yīng)用,相關(guān)文獻(xiàn)研究表明僅有33.65%的文獻(xiàn)涉及表觀指標(biāo)的分析[8]。 病理指標(biāo)可從微觀角度反映組織病理學(xué)變化,故局部組織病理學(xué)變化常常被用來評價黃褐斑動物模型或在動物水平評價藥物治療黃褐斑的療效,是評價黃褐斑動物模型的金指標(biāo)[8,14]。 在評價方法上,HE 染色可以看到局部皮膚組織的結(jié)構(gòu)變化,但在該條件下黑色素通常呈黃棕色或棕褐色,不易與其它色素區(qū)分,而Masson-Fontana 染色后可以清楚的看到呈黑色的黑色素,根據(jù)黃褐斑獲得性色素沉著的疾病特點,目前多使用HE 染色、Masson-Fontana 染色以及免疫組化等方法對局部皮膚中黑色素顆粒、黑色素細(xì)胞的數(shù)量以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行定性和定量分析[8,15-16]。

3.1 黃體酮注射劑量對復(fù)制SD 大鼠、KM 小鼠黃褐斑模型的影響

根據(jù)國內(nèi)模型多選用SD 大鼠和KM 小鼠以及多采用肌注黃體酮注射液建立黃褐斑模型的研究現(xiàn)狀,本研究采用肌內(nèi)注射黃體酮注射液,每天一次,連續(xù)30 d 的方法復(fù)制SD 大鼠、KM 小鼠黃褐斑動物模型。 因黃體酮的注射劑量是影響模型成功與否的關(guān)鍵因素,而目前所建立的模型中,SD 大鼠的注射劑量存在較多爭議,常用劑量有7.5 mg/(kg·d)[17]、10 mg/(kg·d)[10]、20 mg/(kg·d)[18]和 25 mg/(kg·d)[10],所以本研究同時設(shè)置了高、中、低(25 mg/(kg·d)、15 mg/(kg·d)、7.5 mg/(kg·d))三個劑量,在同一實驗條件下探討黃體酮劑量對SD大鼠黃褐斑模型的影響。 通過文獻(xiàn)調(diào)研,KM 小鼠的注射劑量比較一致,多為20 mg/(kg·d)[19-20],所以本研究僅探討了高、低(30 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d))兩個劑量黃體酮對模型的影響,以利于優(yōu)化模型。

建模完成后,SD 大鼠和KM 小鼠背部皮膚組織HE 染色和Masson-Fontana 染色結(jié)果顯示,各組均未觀察到明顯的黑色素顆粒。 我們推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與造模方法或者動物品系的選擇密切相關(guān)。 有文獻(xiàn)報道使用肌內(nèi)注射7.5 mg/(kg·d)的黃體酮注射液,連續(xù)30 d 的方法建立了花豚鼠黃褐斑動物模型[21],說明黃體酮造模方法的可行性。同時本研究根據(jù)文獻(xiàn)中報道的常用劑量對黃體酮設(shè)置了多個濃度考察,因此也排除黃體酮注射劑量問題對造模的影響。

黑色素作為維持正常皮膚顏色的一種色素,正常組皮膚的表皮基底層也應(yīng)該能看到少量黑色素顆粒,但本實驗中正常SD 大鼠和KM 小鼠均未觀察到黑色素表達(dá)。 有研究表明白化鼠沒有活躍的黑色素細(xì)胞,不能用來研究色素斑、老年痣等色素沉著性疾病[22],而SD 大鼠和KM 小鼠均屬于白化鼠,因此種屬可能是導(dǎo)致模型復(fù)制出現(xiàn)問題的原因。

3.2 不同造模方法對復(fù)制C57BL/6 小鼠黃褐斑模型的影響

鑒于國外學(xué)者在動物水平研究黑色素時常使用紫外線照射的方法建立C57BL/6 小鼠黃褐斑動物模型[9,23],該品系動物不是白化病鼠,因此,本研究選用了C57BL/6 小鼠,采用紫外線照射以及紫外線照射聯(lián)合黃體酮的方法探討造模方法對黃褐斑模型的影響,通過對比C57BL/6 小鼠與SD 大鼠、KM 小鼠的實驗結(jié)果,也可以進(jìn)一步說明動物品系對黃褐斑模型的影響。 另外,因目前使用C57BL/6小鼠建立黃褐斑動物模型的觀測部位多選擇耳部,有研究表明C57BL/6 小鼠的耳部皮膚較軀干皮膚含有更多的黑色素細(xì)胞[23],所以本研究同時選取耳部、背部皮膚組織作為觀察部位,以驗證C57BL/6小鼠黑色素細(xì)胞表達(dá)的活躍部位。

造模后,正常組背部皮膚組織表皮基底層可以觀察到散在分布的黑色素顆粒,正常組的耳部皮膚組織表皮基底層可以觀察到明顯的黑色素顆粒,利用紫外線照射以及紫外線聯(lián)合黃體酮的方法建立C57BL/6 小鼠模型后,光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠背部和耳部皮膚組織HE 染色和Masson-Fontana 染色結(jié)果,各組均可以觀察到黑色素顆粒的存在,且造模組的黑色素顆粒較正常組明顯增多,耳部皮膚較背部皮膚更明顯。 此外,背部、耳部皮膚組織的HE 染色和Masson-Fontana 染色的結(jié)果提示,兩種方法均可成功復(fù)制黃褐斑模型。

黃褐斑作為一種損容性疾病,其確切發(fā)病機制尚不清楚,臨床發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,所以深入研究黃褐斑對于明確其發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機制以及降低發(fā)病率具有重要的臨床意義和社會價值。因病理指標(biāo)是評價黃褐斑動物模型成功與否的金指標(biāo),而臨床研究難以從組織病理學(xué)角度研究黃褐斑發(fā)生和發(fā)展,存在一定的局限性,所以基于動物模型研究黃褐斑的組織病理學(xué)變化,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行機制研究顯得尤為重要。 本研究結(jié)果顯示,因黃褐斑是一種色素沉著性疾病,在復(fù)制疾病模型時,不建議選擇 SD 大鼠、KM 小鼠等白化鼠,而C57BL/6 小鼠因其耳部皮膚和背部皮膚均含有一定量的黑色素細(xì)胞,是一個較好的復(fù)制黃褐斑動物模型的動物品系。 而在模型復(fù)制的方法上,利用紫外線聯(lián)合黃體酮或者單獨紫外線照射的方法均可建立黃褐斑模型,但模型的維持時間還有待進(jìn)一步實驗探索。 今后,我們將從模型維持時間、紫外線不同照射劑量的對比研究、單獨黃體酮復(fù)制C57BL/6 小鼠模型以及各造模方法的原理等方面進(jìn)一步探索,以期為尋找更合適的造模方法,為黃褐斑的基礎(chǔ)研究提供更多的實驗數(shù)據(jù)支撐。