吳 凱,任 強

(淮北礦工總醫(yī)院心胸外科,安徽淮北 235000)

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤,近年來,食管癌發(fā)病率逐年上升,基因異常表達、致癌信號通路的激活等均可促進食管癌的發(fā)生[1]。 miRNA 屬于非編碼單鏈小RNA 分子,其可通過與靶基因結合從而調(diào)控靶基因表達,miRNA 異常表達可影響多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展[2]。 既往研究顯示miRNA 表達上調(diào)或下調(diào)均可能參與食管癌發(fā)生及發(fā)展過程,并可通過調(diào)控靶基因表達從而影響食管癌細胞增殖、凋亡等生物學行為[3-5]。 miR-338-3p 在胃癌組織中表達下調(diào)[6]。 生物信息學分析顯示W(wǎng)NK1 可能是miR-338-3p 的靶基因,研究表明WNK1 表達量升高并可能促進腎癌發(fā)生及發(fā)展[7]。 但miR-338-3p 是否可通過靶向WNK1 影響食管癌發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。 因此,本研究通過檢測食管癌細胞系中miR-338-3p、WNK1 的表達,探討 miR-338-3p 對食管癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響及二者的靶向關系。

1 材料和方法

1.1 細胞

人正常食管上皮細胞株Het-1A、人食管癌細胞Eca-109、EC-1、EC9706 購自美國 ATCC 公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司;miR-338-3p mimics、miR-con、si-WNK1、si-con、anti-miR-338-3p、anti-miR-con 購自上海吉瑪制藥技術有限公司;qRTPCR 試劑盒(20181203)購自北京天根生化科技有限公司;MTT(20181116)購自上海澤葉生物科技有限公司;細胞凋亡試劑盒(APOAF MSDS)購自美國Sigma 公司;雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶;兔抗人WNK1 抗體購自武漢友聯(lián)特生物技術有限公司;兔抗人 PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 抗體購自美國 Santa Cruz 公司;StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司;FACS Calibur 流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉染及實驗分組

取對數(shù)生長期 EC9706 細胞,待細胞生長至70%融合度時將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基,參照Lipofectamine2000 轉染試劑分別將miR-con、miR-338-3p mimics、si-con、si-WNK1、miR-338-3p mimics 與 pcDNA、miR-338-3p mimics 與 pcDNAWNK1 轉染至EC9706 細胞,分別記作miR-con 組、miR-338-3p 組、si-con 組、si-WNK1 組、miR-338-3p+pcDNA 組、miR-338-3p+pcDNA-WNK1 組。 同時將未經(jīng)轉染的EC9706 細胞作為NC 組。

1.3.2 qRT-PCR 檢測細胞中 miR-338-3p、WNK1 mRNA 的表達水平

收集 Het-1A、Eca-109、EC-1、EC9706 細胞及各組轉染后的EC9706 細胞,采用TRIzol 法提取細胞中的總RNA。 檢測RNA 濃度與純度。 反轉錄合成cDNA。 qRT-PCR 反應條件:95℃ 120 s,94℃ 45 s,60℃ 30 s,70℃ 45 s,共 40 次循環(huán)。 計算 miR-338-3p、WNK1 mRNA 的相對表達量。 miR-338-3p 正向引物 5’-ATCCAGTGCGTGTCGTGG-3’,反向引物5’-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3’;WNK1 正向引物5’-CAGAGTGAGCAGCCAACAGA-3’,反向引物 5’-CCACGGACTGAGGCATACTT-3’;β-actin 正向引物5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’,反向引物 5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’;U6 正向引物 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ’, 反 向 引 物 5 ’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3.3 MTT 檢測細胞增殖

EC9706 細胞每毫升 2.5×104個接種于 96 孔板,每孔 100 μL,加 MTT 溶液 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,應用酶標儀檢測各孔吸光度值(OD)。

1.3.4 流式細胞術評估EC9706 細胞凋亡率

EC9706 細胞在 500 μL 結合緩沖液中重懸,參照試劑盒說明書操作,應用流式細胞儀、FlowJo 軟件分析各組EC9706 細胞的凋亡率。

1.3.5 Transwell 實驗測定 EC9706 細胞遷移及侵襲

EC9706 細胞遷移測定:將各組轉染后的EC9706 細胞(每毫升 2×105個),Transwell 小室上室與下室分別加入細胞懸浮液(200 μL)與DMEM培養(yǎng)基(600 μL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定后進行結晶紫溶液染色,觀察遷移細胞數(shù)。 EC9706 細胞侵襲實驗:Transwell 小室上室使用稀釋的Matrigel基質(zhì)膠(100 μL),包被 5 h。 后續(xù)按照 EC9706 細胞遷移測定的步驟檢測侵襲細胞數(shù)。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-338-3p 的靶基因

TargetScan 預測 miR-338-3p 與 WNK1-3’UTR存在結合位點,構建野生型載體WT-WNK1、突變型載體 MUT-WNK1(美國 Promega 公司),于 EC9706細胞中分別共同轉染 WT-WNK1、MUT-WNK1 與miR-con、miR-338-3p mimics,收集 48 h 后的 EC9706細胞進行熒光素酶活性測定。

1.3.7 Western blot 檢測 EC9706 細胞中 WNK1 蛋白、PCNA 蛋白、Cleaved caspase-3 蛋白、MMP-2 蛋白及MMP-9 蛋白表達

提取細胞總蛋白,BCA 法檢測蛋白濃度,SDSPAGE 分離蛋白,轉膜,封閉2 h,依次分別加入一抗稀釋液與二抗稀釋液,通過Image J 軟件進行各條帶灰度值的分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)在SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件中整理分析,結果表示為平均數(shù)±標準差(),兩組間、多組間數(shù)據(jù)比較分別采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析,P<0.05 代表差異顯著,具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常食管上皮細胞和食管癌細胞中miR-338-3p 和 WNK1 的表達

見圖 1、表 1,qRT-PCR 法與 Western blot 法分別檢測食管癌細胞Eca-109、EC-1、EC9706 中miR-338-3p、WNK1 mRNA 及蛋白的表達量,結果顯示,食管癌細胞 Eca-109、EC-1、EC9706 中 miR-338-3p 的表達量顯著低于Het-1A 細胞,WNK1 mRNA 和WNK1蛋白的表達量顯著高于Het-1A 細胞(P<0.05)。 表明miR-338-3p 在食管癌中呈低表達,而WNK1 在食管癌細胞中呈高表達。

圖1 正常食管上皮細胞和食管癌細胞中WNK1 蛋白表達Figure 1 WNK1 protein expression in normal esophageal epithelial cells and esophageal cancer cells

表1 qRT-PCR 檢測正常食管上皮細胞和食管癌細胞中miR-338-3p 和 WNK1mRNA 的表達及Western blot檢測WNK1 蛋白的表達(,n=9)Table 1 qRT-PCR to detect the expression of miR-338-3p and WNK1mRNA in normal esophageal epithelial cells and esophageal cancer cells, and Western blot to detect the expression of WNK1 protein

表1 qRT-PCR 檢測正常食管上皮細胞和食管癌細胞中miR-338-3p 和 WNK1mRNA 的表達及Western blot檢測WNK1 蛋白的表達(,n=9)Table 1 qRT-PCR to detect the expression of miR-338-3p and WNK1mRNA in normal esophageal epithelial cells and esophageal cancer cells, and Western blot to detect the expression of WNK1 protein

注:與Het-1A 組相比較,*P<0.05。Note. Compared with the Het-1A group, *P<0.05.

分組Groups miR-338-3p WNK1 mRNA WNK1 蛋白WNK1 protein Het-1A 1.04±0.07 0.99±0.12 0.34±0.04 Eca-109 0.52±0.08* 4.04±0.40* 0.53±0.06*EC-1 0.48±0.06* 4.58±0.45* 0.69±0.07*EC9706 0.39±0.05* 5.15±0.48* 0.82±0.08*F 178.121 204.239 93.745 P 0.000 0.000 0.000

2.2 轉染miR-338-3p 抑制食管癌細胞EC9706 增殖和誘導細胞凋亡

見圖2、表2,MTT 法、流式細胞術分別檢測細胞活力及凋亡率,采用 Western blot 法檢測 PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表達量,結果顯示,miR-338-3p 組食管癌細胞EC9706 的細胞活力、PCNA 蛋白表達量低于miR-con 組(P<0.05),而細胞凋亡率和Cleaved caspase-3 蛋白表達量顯著高于miR-con 組(P<0.05)。 表明miR-338-3p 過表達能夠抑制食管癌細胞增殖及促進細胞凋亡。

表2 轉染miR-338-3p 對食管癌細胞EC9706 凋亡和PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表達生物影響(,n=9)Table 2 Biological effects of miR-338-3p transfection on apoptosis and expression of PCNA and cleaved caspase-3 protein in esophageal cancer cell line EC9706

表2 轉染miR-338-3p 對食管癌細胞EC9706 凋亡和PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表達生物影響(,n=9)Table 2 Biological effects of miR-338-3p transfection on apoptosis and expression of PCNA and cleaved caspase-3 protein in esophageal cancer cell line EC9706

注:與miR-con 組相比較,*P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05.

分組Groups miR-338-3p PCNA Cleaved caspase-3 細胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate 細胞活力(%)Cell viability NC 0.98±0.08 0.58±0.07 0.22±0.02 2.92±0.35 101.32±5.44 miR-con 0.94±0.11 0.62±0.08 0.25±0.03 3.45±0.56 97.36±6.58 miR-338-3p 7.58±0.68* 0.29±0.06* 0.72±0.07* 15.26±1.44* 63.45±5.93*F 820.192 58.772 342.435 523.627 108.266 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 轉染miR-338-3p 對食管癌細胞EC9706 凋亡和PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表達生物影響Note. A, Detection of PCNA and Cleaved caspase-3 protein expression in cells by transfection of miR-338-3p. B, Detection of cell apoptosis by transfection of miR-338-3p.Figure 2 Biological effects of miR-338-3p transfection on apoptosis and expression of PCNA and cleaved caspase-3 protein in esophageal cancer cell line EC9706

2.3 轉染miR-338-3p 抑制食管癌細胞EC9706 遷移和侵襲

Transwell 實驗檢測細胞遷移及侵襲,Western blot 法檢測 MMP-2、MMP-9 蛋白水平,結果顯示,與miR-con 組比較,miR-338-3p 組食管癌細胞EC9706的遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖3、表3。 表明miR-338-3p 過表達可抑制食管癌細胞遷移及侵襲。

表3 轉染miR-338-3p 抑制食管癌細胞EC9706 遷移和侵襲(,n=9)Table 3 Transfection of miR-338-3p inhibits migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

表3 轉染miR-338-3p 抑制食管癌細胞EC9706 遷移和侵襲(,n=9)Table 3 Transfection of miR-338-3p inhibits migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:與miR-con 組相比較,*P<0.05。Note. Compared with the miR-con group, *P<0.05.

Groups MMP-2 MMP-9 遷移細胞數(shù)Cell migration number分組侵襲細胞數(shù)Cell invasion number NC 1.12±0.09 0.77±0.08 294.53±15.73 127.64±8.37 miR-con 1.15±0.11 0.74±0.08 278.59±19.17 117.92±11.70 miR-338-3p 0.62±0.07* 0.44±0.05* 114.04±8.48* 62.64±5.74*F 95.343 58.765 392.503 138.349 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 轉染miR-338-3p 對食管癌細胞EC9706 中遷移、侵襲、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達的影響Note. A, Detection of cell migration and invasion by transfection of miR-338-3p. B,Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expression in cells by transfection of miR-338-3p.Figure 3 Effects of miR-338-3p transfection on migration, invasion and expression of MMP-2 and MMP-9 in EC9706 cells

2.4 miR-338-3p 靶向、調(diào)控 WNK1

TargetScan 軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-338-3p 與WNK1存在互補序列,見圖4A。 雙熒光素酶報告實驗結果顯示miR-338-3p 過表達可降低WT-WNK1 熒光素酶活性(P<0.05),而對MUT-WNK1 熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05),見表4。 與miR-con 組比較,miR-338-3p 組細胞中WNK1 蛋白水平顯著降低(P<0.05);與 anti-miR-con 組比較,anti-miR-338-3p 組細胞中WNK1 蛋白水平顯著升高(P<0.05),見圖4B、表 5。 表明 miR-338-3p 可靶向結合 WNK1,并可負向調(diào)控WNK1 的表達。

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)Table 4 Double luciferase report experiment

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)Table 4 Double luciferase report experiment

注:與 miR-con 組比較,*P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05.

分組Groups野生型WNK1WT-WNK1突變型WNK1MUT-WNK1 miR-con 1.07±0.07 1.12±0.09 miR-338-3p 0.55±0.08* 1.15±0.08 t 14.675 0.747 P 0.000 0.466

表5 miR-338-3p 靶向調(diào)控WNK1 表達(,n=9)Table 5 miR-338-3p targets WNK1 expression

表5 miR-338-3p 靶向調(diào)控WNK1 表達(,n=9)Table 5 miR-338-3p targets WNK1 expression

注:與 miR-con 組比較,*P<0.05;與 anti-miR-con 組比較,#P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05. Compared with antimiR-con group, #P<0.05.

分組Groups WNK1 miR-con 0.63±0.06 miR-338-3p 0.28±0.04*anti-miR-con 0.58±0.06 anti-miR-338-3p 1.25±0.09#F 353.112 P 0.000

圖4 miR-338-3p 與WNK1 存在互補序列并調(diào)控WNK1 蛋白表達Note. A, miR-338-3p and WNK1 had complementary sequences. B, Western blot was used to detect the expression of WNK1 protein.Figure 4 miR-338-3p has complementary sequence with WNK1 and regulates WNK1 protein expression

2.5 沉默WNK1 抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲

MTT 法、流式細胞術、Transwell 實驗分別檢測細胞活力、凋亡率、遷移及侵襲,Western blot 法檢測PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 蛋白水平,結果顯示,與 si-con 組比較,si-WNK1 組 EC9706 細胞活力、PCNA、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達量顯著減少,而EC9706 細胞凋亡率和Cleaved caspase-3 蛋白水平明顯增強,遷移細胞數(shù)與侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),見圖5、表 6。 表明沉默 WNK1 可抑制食管癌細胞增殖、遷移及侵襲。

表6 沉默WNK1 抑制食管癌細胞EC9706 增殖、遷移和侵襲(,n=9)Table 6 Silencing WNK1 inhibits proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

表6 沉默WNK1 抑制食管癌細胞EC9706 增殖、遷移和侵襲(,n=9)Table 6 Silencing WNK1 inhibits proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:與 si-con 組比較,*P<0.05。Note. Compared with the si-con group, *P<0.05.

分組Groups WNK1 PCNA Cleaved caspase-3 MMP-2 MMP-9遷移細胞數(shù)Cell migration number侵襲細胞數(shù)Cell invasion number細胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate細胞活力(%)Cell viability NC 0.71±0.07 0.55±0.04 0.25±0.02 0.73±0.05 0.61±0.04 291.53±18.26 121.94±9.84 3.25±0.65 99.72±5.49 si-con 0.68±0.05 0.52±0.05 0.28±0.03 0.70±0.07 0.63±0.06 285.07±19.42 114.34±11.96 3.82±0.76 95.37±7.41 si- WNK1 0.17±0.04* 0.22±0.03* 0.82±0.08* 0.35±0.03* 0.32±0.05* 94.43±8.27* 55.07±6.64* 15.81±1.54* 68.68±5.86*F 276.300 179.820 360.818 145.193 105.545 434.622 127.450 402.845 63.879 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 沉默WNK1 對食管癌細胞EC9706 凋亡、遷移、侵襲和WNK1、PCNA、MMP-2 及MMP-9 蛋白表達的影響Note. A, Silencing WNK1 to detect cell apoptosis. B, Detection of WNK1,PCNA,MMP-2 and MMP-9 protein expression in cells by silencing WNK1. C,Detection of cell migration and invasion by silencing WNK1.Figure 5 Effects of WNK1 silencing on apoptosis, migration, invasion and protein expression of WNK1, PCNA, MMP-2 and MMP-9 in esophageal cancer cell line EC9706

2.6 過表達WNK1 部分逆轉miR-338-3p 對食管癌細胞的抑制作用

MTT 法、流式細胞術、Transwell 實驗分別檢測細胞活力、凋亡率、遷移及侵襲,Western blot 法檢測PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 蛋白水平,結果顯示,與miR-338-3p +pcDNA 組比較,miR-338-3p +pcDNA- WNK1 組 EC9706 細胞的活力、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比 miR-338-3p +pcDNA 組顯著增加, 但 EC9706 細胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 蛋白水平較 miR-338-3p +pcDNA 組顯著減少,且EC9706 細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)比miR-338-3p +pcDNA 組顯著提高(P<0.05),見表 7、圖6。 表明WNK1 過表達能夠拮抗miR-338-3p 過表達對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

圖6 miR-338-3p 和過表達WNK1 對食管癌細胞EC9706 凋亡、遷移、侵襲和WNK1、PCNA、MMP-2 及MMP-9 蛋白表達的影響Note. A, Detection of apoptosis by miR-338-3p and overexpression of WNK1. B, Detection of miR-338-3p and overexpression of WNK1 on cell migration and invasion. C, miR-338-3p and overexpression of WNK1 affect the expression of WNK1, PCNA, MMP-2 and MMP-9 proteins in cells.Figure 6 Effects of miR-338-3p and WNK1 overexpression on apoptosis, migration, invasion and protein expression of WNK1,PCNA, MMP-2 and MMP-9 in esophageal cancer cell line EC9706

表7 miR-338-3p 和過表達WNK1 抑制食管癌細胞EC9706 增殖、遷移和侵襲(,n=9)Table 7 miR-338-3p and WNK1 overexpression inhibit proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

表7 miR-338-3p 和過表達WNK1 抑制食管癌細胞EC9706 增殖、遷移和侵襲(,n=9)Table 7 miR-338-3p and WNK1 overexpression inhibit proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:與 miR-338-3p+pcDNA 組比較,*P<0.05。Note. Compared with miR-338-3p+pcDNA group, *P<0.05.

分組Groups WNK1 PCNA Cleaved caspase-3 MMP-2 MMP-9遷移細胞數(shù)Cell migration number侵襲細胞數(shù)Cell invasion number細胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate細胞活力(%)Cell viability miR-338-3p+pcDNA 0.35±0.05 0.28±0.04 0.68±0.05 0.32±0.06 0.39±0.04 113.37±18.48 51.86±6.64 15.92±1.53 98.31±8.46 miR-338-3p+pcDNAWNK1 0.54±0.06* 0.63±0.07* 0.44±0.06* 0.78±0.07* 0.65±0.06*194.58±12.26* 84.27±7.39* 7.28±1.06* 142.54±15.83*F 19.359 13.024 9.219 14.968 10.817 10.994 9.787 13.926 7.393 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

miR-338-3p 在腎癌、宮頸癌、非小細胞肺癌細胞中表達下調(diào),并可調(diào)控細胞的生物學過程,如增殖、遷移及侵襲等[8-10]。 本研究數(shù)據(jù)表明,miR-338-3p 在食管癌細胞系 Eca-109、EC-1、EC9706 中的表達下調(diào),與上述研究結果相似,提示miR-338-3p 在食管癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。 本研究結果顯示miR-338-3p 過表達后食管癌細胞增殖能力顯著降低,進一步分析顯示miR-338-3p 過表達后可抑制食管癌細胞中PCNA 的表達,PCNA 表達量升高可促進細胞增殖[11]。 本研究結果提示miR-338-3p 過表達可能通過抑制食管癌細胞PCNA 的表達,發(fā)揮抗食管癌增殖、遷移及侵襲,和促食管癌細胞凋亡的作用,還可增強Cleaved caspase-3 表達,抑制 MMP-2、MMP-9 表達,與相關文獻報道相似[12-13]。 提示miR-338-3p 過表達可促進細胞凋亡及抑制食管癌細胞遷移及侵襲。

miR-93 通過抑制WNK1 表達從而抑制三陰性乳腺癌細胞遷移及侵襲[14]。 研究表明WNK1 在腫瘤細胞中表達上調(diào)并可促進細胞遷移[15]。 與上述研究結果相似,本研究結果顯示W(wǎng)NK1 在食管癌中表達上調(diào),沉默WNK1 表達能減弱食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并誘導食管癌細胞的凋亡,雙熒光素酶報告實驗進一步證實WNK1 是miR-338-3p 的靶基因。 本研究結果顯示W(wǎng)NK1 過表達后,miR-338-3p 過表達調(diào)控食管癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用被逆轉。

綜上所述,miR-338-3p 在食管癌細胞中呈低表達,WNK1 的表達量明顯升高,miR-338-3p 過表達可抑制食管癌細胞增殖、遷移及侵襲,并可促進細胞凋亡,其作用機制可能與靶向WNK1 而上調(diào)Cleaved caspase-3 表達及抑制 PCNA、MMP-2、MMP-9 表達有關,miR-338-3p 可能成為食管癌靶向治療的潛在靶點。 但仍需進行體內(nèi)動物實驗驗證miR-338-3p 的抑癌基因作用。