陽(yáng) 麗,吳 湘,李 昂,何薇薇

(湖南省婦幼保健院,長(zhǎng)沙 410008)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是臨床常見婦科內(nèi)分泌疾病,會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,而PCOS 中出現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞明顯凋亡情況,而凋亡與自噬之間存在較多交叉位點(diǎn),且自噬參與許多生理病理過(guò)程[1-2]。 卵巢顆粒細(xì)胞自噬可影響卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖,從而影響生育功能[3]。 黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)在黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的肺癌中可以抑制自噬從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4],但在PCOS 中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。沉默信息調(diào)節(jié)因子1/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(silent mating type information regulation 2 homolog 1/forkhead box transcription factor O1,Sirt1/FoxO1)作為自噬相關(guān)通路在PCOS 卵巢組織中處于激活狀態(tài),可以通過(guò)對(duì)顆粒細(xì)胞、卵泡細(xì)胞的調(diào)控從而抑制卵泡正常發(fā)育過(guò)程[5],且本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PCOS 中顆粒細(xì)胞自噬現(xiàn)象明顯。 APS 是否影響PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞自噬尚不清楚。 因此,建立PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞自噬模型,探究APS 對(duì)其影響,為臨床提供一定依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 只 SPF 級(jí)雌性 SD 大鼠,6 周齡、體重 190~210 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養(yǎng)在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院[SYXK(湘)2017-0002]。 在溫度 24℃ ~25℃、濕度50%~60%、自然光照、自由攝食飲水,定時(shí)通風(fēng)環(huán)境中飼養(yǎng)。 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R 原則給予人道關(guān)懷,經(jīng)湖南省婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2020-S061)。

1.2 主要試劑與儀器

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(上海生物化學(xué)制藥廠,批號(hào):820120);CCK8 試劑盒、一抗促卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)、Sirt1、FoxO1、哺乳動(dòng)物同族物微管相關(guān)蛋白1 輕鏈 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、β-actin(美國(guó) abcam 公司,貨號(hào)分別為:ab228554、ab150557、 ab189494、 ab58518、 ab229327、ab179467);丙酸睪丸酮(中國(guó) aladdin 科技公司,CAS 號(hào):57-85-2);自噬誘導(dǎo)劑C2-神經(jīng)酰胺(美國(guó)Sigma 公司,批號(hào):A7191);APS(純度90%)(中國(guó)上海源葉生物科技公司,批號(hào):20170316)。 酶標(biāo)儀(中國(guó)BioBase 公司,型號(hào):inark);透射電鏡(日立高新科技有限公司,型號(hào):ChromAssist Data Station);蛋白凝膠系統(tǒng)(上海Bio-Rad 公司,型號(hào):7500)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境中大鼠皮下注射50 IU PMSG,48 h 后大鼠處死,無(wú)菌條件下摘取卵巢,去除周圍脂肪組織,低倍鏡下用25 號(hào)針頭刺破卵泡,輕輕擠壓,逸出卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞,吹打使細(xì)胞分離,200 目網(wǎng)篩過(guò)濾,800 r/min 離心10 min,棄上清,收集細(xì)胞。 取部分細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),未見藍(lán)染的為死細(xì)胞。將顆粒細(xì)胞稀釋密度為每毫升1×105個(gè),添加10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 免疫熒光鑒定離體的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48 h 后經(jīng)胰蛋白酶消化,直至消化成單個(gè)圓形細(xì)胞,添加DMEM/F12 終止消化,收集細(xì)胞置于含載玻片的24 孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞爬片,待密度約70%時(shí),多聚甲醛固定,細(xì)胞免疫熒光染色。 滴加一抗 FSHR(1 ∶200)4℃封閉過(guò)夜,滴加二抗,室溫孵育1 h,熒光顯微鏡鹵素2 燈光源激發(fā)綠色熒光,進(jìn)行觀察拍照。

1.3.3 CCK8 檢測(cè) APS 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響

每毫升1×105個(gè)正常卵巢顆粒細(xì)胞接種至96孔板中,待細(xì)胞貼壁后加含 0、100、200、400 μg/mL APS 的10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁,分別在貼壁0 h、24 h加CCK8 試劑繼續(xù)培養(yǎng)1~4 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下各孔細(xì)胞光密度(optic density,OD)。 6 個(gè)重復(fù),3個(gè)平行。 驗(yàn)證APS 對(duì)正常卵巢顆粒細(xì)胞的影響。

1.3.4 PCOS 卵巢顆粒細(xì)胞的自噬模型建立

參考文獻(xiàn)[6]結(jié)合本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)自噬的劑量。在前期研究發(fā)現(xiàn),10-5mol/L 丙酸睪丸酮作用卵巢顆粒細(xì)胞 24 h 可以建立 PCOS 細(xì)胞模型,1、2、5、10、20 μmol/L C2-神經(jīng)酰胺作用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞24、48 h,細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC 熒光染色)檢測(cè)細(xì)胞自噬情況。

1.3.5 細(xì)胞分組及給藥處理

正常大鼠分離的顆粒細(xì)胞為正常組,模型組、100、200、400 μg/mL APS 組。 正常組為鑒定過(guò)的卵巢顆粒細(xì)胞,其余各組添加丙酸睪丸酮+C2-神經(jīng)酰胺作用 24 h。 24 h 后更換培養(yǎng)液,100、200、400 μg/mL APS 組分別用含 100、200、400 μg/mL APS 10%胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng),模型組、正常組用正常10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將1.3.5 各組細(xì)胞處理24 h 后,參考1.3.3中CCK8 試劑處理方法,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3.7 透射電鏡觀察自噬體情況

將1.3.5 各組細(xì)胞處理24 h 后細(xì)胞消化后爬片,乙醇及丙酮脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋,超薄切片機(jī)切片(厚度:60 nm),醋酸雙氧軸-檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察并拍照。

1.3.8 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Sirt1、FoxO1、LC3蛋白表達(dá)情況

將1.3.5 各組細(xì)胞處理24 h 后添加蛋白裂解液,冰上裂解10 min,4℃ 13000 r/min 離心10 min收集總蛋白,上樣20 μg,PVDF 膜轉(zhuǎn)膜后封閉;加入一抗 Sirt1、FoxO1、LC3、β-actin,4℃ 孵育過(guò)夜;加入對(duì)應(yīng)二抗,蛋白凝膠系統(tǒng)定量分析,待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平=待測(cè)蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述,多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定結(jié)果

FSHR 蛋白在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的平均陽(yáng)性表達(dá)量93.18%>90%,見圖1。 可進(jìn)行接下來(lái)實(shí)驗(yàn)。

圖1 大鼠顆粒細(xì)胞的鑒定Figure 1 Identification of rat granulosa cells

2.2 APS 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響

0、100、200、400 μg/mL APS 處理正常卵巢顆粒細(xì)胞,分別在貼壁0、24 h 比較,細(xì)胞OD450差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表1。

表1 不同濃度APS 處理下卵巢顆粒細(xì)胞OD450水平比較(,n=6)Table 1 Comparison of OD450 levels in ovarian granulosa cells treated with different concentrations of APS

表1 不同濃度APS 處理下卵巢顆粒細(xì)胞OD450水平比較(,n=6)Table 1 Comparison of OD450 levels in ovarian granulosa cells treated with different concentrations of APS

組別Groups OD450 0 h 24 h 0 μg/mL APS 2.16±0.34 3.41±0.35 100 μg/mL APS 2.41±0.27 3.68±0.42 200 μg/mL APS 2.37±0.25 3.78±0.35 400 μg/mL APS 2.29±0.19 3.95±0.69 F 1.016 1.366 P 0.406 0.282

2.3 PCOS 卵巢顆粒細(xì)胞的自噬模型建立情況

1、2、5、10、20 μmol/L C2-神經(jīng)酰胺作用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞24、48 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2-神經(jīng)酰胺在10、20 μmol/L 處理細(xì)胞 24 h、5、10、20 μmol/L 處理細(xì)胞48 h 均可誘導(dǎo)自噬抑制細(xì)胞增殖,結(jié)合文獻(xiàn)及自噬效果,確定10-5mol/L 丙酸睪丸酮、10 μmol/L C2-神經(jīng)酰胺作用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞24 h 構(gòu)建PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬模型。

2.4 APS 對(duì)PCOS 卵巢顆粒自噬細(xì)胞增殖的影響

正常組、模型組、100、200、400 μg/mL APS 組在細(xì)胞貼壁 0 h 時(shí),OD450差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 細(xì)胞貼壁24 h,與正常組相比,模型組細(xì)胞OD450降低(P<0.05);與模型組相比,100、200、400 μg/mL APS 組細(xì)胞 OD450升高(P<0.05)。 見表 2。

表2 5 組細(xì)胞中OD450水平比較(,n=6)Table 2 Comparison of OD450 levels in 5 groups

表2 5 組細(xì)胞中OD450水平比較(,n=6)Table 2 Comparison of OD450 levels in 5 groups

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05。Note. Compared with the normal group, #P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05.

組別Groups OD450 0 h 24 h正常組Normal group 2.33±0.34 4.06±0.36模型組Model group 2.43±0.26 2.96±0.30#100 μg/mL APS 組100 μg/mL APS group 2.39±0.37 3.51±0.35*200 μg/mL APS 組200 μg/mL APS group 2.43±0.25 3.58±0.29*400 μg/mL APS 組400 μg/mL APS group 2.44±0.36 4.67±0.35*F 0.122 22.593 P 0.973 0.000

2.5 APS 對(duì)PCOS 卵巢顆粒自噬細(xì)胞自噬的影響

與正常組相比,模型組細(xì)胞核附近出現(xiàn)大量自噬小體,雙層、單層膜包裹胞質(zhì)形成封閉、圓形結(jié)構(gòu),部分自噬小體內(nèi)膜溶解,自噬小體周圍可見單層膜結(jié)構(gòu)包裹著一些被降解的胞漿、類似自噬小體結(jié)構(gòu);100 μg/mL APS 組與模型組結(jié)構(gòu)類似,隨著APS 劑量的升高,自噬小體數(shù)量減少,在400 μg/mL APS 組時(shí)正常。 見圖 2。

圖2 5 組細(xì)胞中細(xì)胞自噬情況Note. A, Normal group. B,Model group. C,100 μg/mL APS group. D,200 μg/mL APS group. E,400 μg/mL APS group.Figure 2 Autophagy in group 5 cells

2.6 APS 對(duì) PCOS 卵巢顆粒自噬細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3 蛋白的影響

與正常組相比,模型組細(xì)胞中Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高(P<0.05);與模型組相比,100、200、400 μg/mL APS 組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白水平降低(P<0.05)。 見圖 3、表3。

表3 5 組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平比較(,n=6)Table 3 Comparison of Sirt1, FoxO1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ protein levels in cells of groups 5

表3 5 組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平比較(,n=6)Table 3 Comparison of Sirt1, FoxO1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ protein levels in cells of groups 5

注:與正常組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05。Note. Compared with the normal group, #P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05.

組別Groups Sirt1 FoxO1 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ正常組Normal group 0.15±0.03 0.09±0.01 1.86±0.03模型組Model group 0.87±0.08# 0.96±0.08# 3.86±0.25#100 μg/mL APS 組100 μg/mL APS group 0.39±0.04* 0.54±0.04* 2.76±0.05*200 μg/mL APS 組200 μg/mL APS group 0.13±0.02* 0.13±0.02* 1.26±0.15*400 μg/mL APS 組400 μg/mL APS group 0.07±0.04* 0.11±0.02* 1.38±0.05*F 229.229 489.202 390.917 P 0.000 0.000 0.000

圖3 5 組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3 蛋白表達(dá)情況Note. A, Normal group. B, Model group. C, 100 μg/mL APS group. D, 200 μg/mL APS group. E, 400 μg/mL APS group.Figure 3 Expression of Sirt1, FoxO1 and LC3 protein in 5 groups

3 討論

顆粒細(xì)胞是卵泡主要功能細(xì)胞,與卵細(xì)胞成熟和排卵關(guān)系密切,而PCOS 中顆粒細(xì)胞減少,導(dǎo)致患者無(wú)卵[7];在本研究中以大鼠中分離卵巢顆粒細(xì)胞作為研究對(duì)象,FSHR 在卵巢顆粒細(xì)胞上表達(dá),細(xì)胞膜上免疫熒光陽(yáng)性定位,可用FSHR 陽(yáng)性率反映分離的細(xì)胞純度,當(dāng)純度>90%時(shí)說(shuō)明所分離顆粒細(xì)胞可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 本研究中FSHR 蛋白在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的平均陽(yáng)性表達(dá)量93.18%>90%,可用于研究。 顆粒細(xì)胞減少這一現(xiàn)象與細(xì)胞凋亡有關(guān),而凋亡與自噬存在多重交叉,二者具有多種共同調(diào)控因子,且自噬是凋亡的必要條件,相互促進(jìn)共同影響疾病[8]。 在本研究中發(fā)現(xiàn),10-5mol/L 丙酸睪丸酮、10 μmol/L C2-神經(jīng)酰胺作用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞24 h 構(gòu)建PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬模型,模型組細(xì)胞增殖下降,細(xì)胞核附近出現(xiàn)大量自噬小體,部分自噬小體內(nèi)膜溶解,自噬小體周圍可見單層膜結(jié)構(gòu)包裹著一些被降解的胞漿、類似自噬小體結(jié)構(gòu),提示卵巢顆粒細(xì)胞自噬現(xiàn)象明顯,模型建立成功。 APS 是黃芪干燥根主要的活性成分之一,具有介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng),降低機(jī)體傷害等功能[9];在T淋巴細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后自噬過(guò)多中具有抑制自噬功能,從而緩解順鉑對(duì)機(jī)體的傷害[10]。 為改善機(jī)體功能,APS 在PCOS 卵巢顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬中是否發(fā)揮作用尚不情況。 不同劑量APS 處理正常卵巢顆粒細(xì)胞,各組細(xì)胞OD450差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示APS 對(duì)正常卵巢顆粒細(xì)胞增殖影響不明顯。 但經(jīng)誘導(dǎo)PCOS 顆粒細(xì)胞自噬后不同劑量APS 處理,各組細(xì)胞OD450升高、自噬現(xiàn)象也得到緩解,提示APS可以抑制PCOS 卵巢顆粒細(xì)胞自噬現(xiàn)象,從而緩解自噬過(guò)度對(duì)機(jī)體的影響。

FoxO 轉(zhuǎn)錄因子是一類關(guān)鍵調(diào)控自噬因子,激活FoxO 可加強(qiáng)自噬,從而影響細(xì)胞增殖、凋亡、存活、周期等過(guò)程[11]。 FoxO 中以 FoxO1、FoxO3 廣泛存在,2007 年采用Northern 雜交和實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)檢測(cè) FoxO1 存在于心臟、肝、頭腦、骨骼、卵巢、睪丸、脾、胰腺等處,存在廣泛[12]。 FoxO1 能夠激活細(xì)胞參與自噬活動(dòng),同時(shí)在分子水平上參與細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程[13]。 FoxO1 轉(zhuǎn)錄活性受Sirt1 等上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)節(jié),而Sirt1 作為沉默信息調(diào)節(jié)因子Sir2 家族主要成員,可以通過(guò)直接作用影響自噬,或通過(guò)調(diào)節(jié)FoxO1 影響自噬[14-16]。 在自噬過(guò)程中特征蛋白LC3 分Ⅰ型和Ⅱ型,其中LC3 Ⅰ存在細(xì)胞質(zhì)中,LC3Ⅱ存在于自噬體膜上[17],自噬發(fā)生時(shí)LC3 Ⅰ被ATG7 活化后轉(zhuǎn)運(yùn)至ATG3,并在ATG3 作用修飾為L(zhǎng)C3 Ⅱ,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ反映自噬情況[18];在PCOS 卵巢顆粒細(xì)胞自噬中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例升高反映自噬狀況[19]。 FoxO1 可以通過(guò)調(diào)節(jié)LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ影響自噬[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高,提示在PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬中激活Sirt1 調(diào)控FoxO1,從而LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,促進(jìn)自噬。 與模型組相比,100、200、400 μg/mL APS 組細(xì)胞中 Sirt1、FoxO1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低,提示APS 可能是通過(guò)抑制Sirt1/FoxO1 通路發(fā)揮對(duì)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬的緩解,從而降低細(xì)胞損傷。

綜上所述,APS 可能通過(guò)抑制Sirt1/FoxO1 通路發(fā)揮抑制PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬作用,本文首次證明APS 可減輕PCOS 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬。 但影響自噬通路較多,亦可能通過(guò)別的通路發(fā)揮作用,探究更多信號(hào)通路是接下來(lái)研究的內(nèi)容。