王路祎 張月華 張鑫 劉情 石海燕

[摘要] 目的 探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）對子宮內(nèi)膜癌（EC）移植瘤生長的影響。

方法 建立裸鼠人EC移植瘤模型。隨機(jī)分為對照組、ARB組、ACEI組。飼養(yǎng)28 d處死小鼠，測量體質(zhì)量、腫瘤體積和質(zhì)量，計算腫瘤抑制率。檢測移植瘤的微血管密度變化和細(xì)胞凋亡水平變化。蛋白免疫印跡檢測EC組織血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE1）的表達(dá)。

結(jié)果 AT1R和ACE1在EC組織中表達(dá)增加（t=39.631、64.313，P均<0.05）;與對照組比較，ARB組與ACEI組在21、28、35 d的腫瘤體積降低（t=9.534～13.226，P均<0.05），微血管密度減?。╰=10.944、11.563，P均<0.05），血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)下降（t=11.523、12.076，P均<0.05），細(xì)胞凋亡率上調(diào)（t=12.209、14.782，P均<0.05）。

結(jié)論 ARB和ACEI均可以抑制EC移植瘤的生長。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜腫瘤;血管緊張素受體拮抗劑;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥;細(xì)胞增殖;血管內(nèi)皮生長因子類;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R737.33;R962.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0691-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.174

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20211029.1710.001.html;2021-11-01 15：44：01

ANGIOTENSIN Ⅱ RECEPTOR ANTAGONIST AND ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME INHIBITOR REGULATE SUBCUTANEOUS TRANSPLANTED TUMOR GROWTH IN NUDE MICE WITH HUMAN ENDOMETRIAL CANCER

WANG Luyi， ZHANG Yuehua， ZHANG Xin， LIU Qing， SHI Haiyan

（Department of Pathology， Foshan first Peoples Hospital， Foshan 528000， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of angiotensin Ⅱ receptor antagonist （ARB） and angiotensin converting enzyme inhibitor （ACEI） on the growth of transplanted endometrial carcinoma （EC） tumor.

Methods The xenograft model of human EC tumor was established in nude mice. The mice were randomly divided into control group， ARB group and ACEI group. At 28 d， the body weight， tumor volume and mass were measured， and the tumor inhibition rate was calculated. The changes of microvascular density and apoptosis were detected. The expression of angiotensin Ⅱ receptor 1 （AT1R） and angiotensin converting enzyme （ACE1） in EC tissues were detected by Western blot.

Results The expression of AT1R and ACE1 increased in EC tissues （t=39.631，64.313;P<0.05）.? Compared with the control group， tumor volume of the ARB group and the ACEI group decreased at 21，28 and 35 d （t=9.534-13.226，P<0.05）， decreased microvascular density （t=10.944，11.563;P<0.05） and vascular? endothelial growth factor （VEGF） expression （t=11.523，12.076;P<0.05）， and increased apoptosis rate （t=12.209，14.782;P<0.05）.

Conclusion Both ARB and ACEI can inhibit the growth of EC cell transplanted tumor.

[KEY WORDS] endometrial neoplasms; angiotensin receptor antagonists; angiotensin-converting enzyme inhibitors; cell proliferation; vascular endothelial growth factors; apoptosis

子宮內(nèi)膜癌（EC）是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增高[1]。EC病人血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）陽性群體的無病生存期明顯縮短[2]。乳癌組織中AT1R的陽性率為48%，與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明AT1R可能和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。另外，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE1）在EC中上調(diào)，且與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。ACE1抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）均可抑制腫瘤細(xì)胞生長和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）介導(dǎo)的血管生成，并促進(jìn)凋亡和壞死[5-7]。然而，ACEI和ARB對EC移植瘤生長的影響仍不清楚。為此，我們建立了裸鼠EC移植瘤模型，分別使用ARB（氯沙坦）和ACEI（卡托普利）進(jìn)行灌胃干預(yù)，以確定二者是否可抑制EC移植腫瘤的生長。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人EC樣本收集 2017年1月—2019年3月，從我院接受手術(shù)的病人中獲得18例EC組織和相鄰的正常組織，置于-80 ℃液氮中保存。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，參與者均知情同意。

1.1.2 細(xì)胞系與試劑藥品 人EC細(xì)胞株HEC-1-B，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心?？ㄍ衅绽徲谥忻郎虾Ｊ┵F寶制藥有限公司。氯沙坦購于杭州默沙東制藥有限公司。TRIzol試劑購于美國英杰公司;ACE1抗體（ab75762）、AT1R抗體（ab124505）、VEGF-A抗體（ab46154）、CD34單克隆抗體（ab81289）均購于美國Abcam公司。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購于凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測ACE1和AT1R基因表達(dá) 使用TRIzol試劑從組織樣品中提取總RNA，使用Reverse Transcription試劑盒（Takara，Dalian，China）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和cDNA合成。用SYBR-Green Real-Time Master Mix（日本）進(jìn)行RT-qPCR分析，檢測ACE1和AT1R基因表達(dá)。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照基因進(jìn)行結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。PCR所用引物及其序列見表1。在Applied Biosystems 7500序列檢測系統(tǒng)（美國，ABI公司）上進(jìn)行qPCR和數(shù)據(jù)收集。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測HEC-1-B細(xì)胞的增殖 將HEC-1-B細(xì)胞懸液按每孔100 μL加入到96孔板，分為3組（對照組，A組;ARB組，B組;ACEI組，C組），其中ARB組用移液槍在實(shí)驗(yàn)孔每孔加10 μg（100 μL）的ARB，ACEI組每孔加10 μg（100 μL）的卡托普利，對照組加100 μL的DMEM培養(yǎng)基，均設(shè)3個復(fù)孔。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)16 h后，加入20 μL的MTT（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL的DMSO，37 ℃振蕩10 min，使用MK3酶標(biāo)儀（美國賽默飛）測定490 nm波長處吸光度。

1.2.3 動物移植瘤模型制作 取雌性4～6周齡BALB/c裸鼠30只（體質(zhì)量15～18 g），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)于佛山市第一人民醫(yī)院病理科SPF級動物房內(nèi)。將HEC-1-B細(xì)胞株（3×107）皮下植入每只裸鼠的腹側(cè)。將小鼠分為3組，每組10只，分別為對照組（A組）、ARB組（B組）和ACEI組（C組）。從細(xì)胞植入之日起，除正常飲食外，對照組每天胃飼生理鹽水0.5 mL，ARB組每天胃飼10 mg/kg氯沙坦0.5 mL，ACEI組每天胃飼10 mg/kg卡托普利0.5 mL。分別于7、14、21、28、35 d稱體質(zhì)量后，以斷頸法處死動物并完整剝離體內(nèi)所有腫瘤包塊，精確測量包塊的體積。將35 d動物剝離腫瘤標(biāo)本部分用無水乙醇保藏并放液氮速凍備用，部分用40 g/L甲醛固定。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動物操作規(guī)范且經(jīng)我院動物倫理委員會審查和批準(zhǔn)。

1.2.4 腫瘤組織免疫染色 將甲醛溶液固定的組織切片（厚度5 μm）與抗CD34單克隆抗體（1∶300）在4 ℃孵育過夜。加入生物素二抗，將標(biāo)本組織與抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物孵育，并用二氨基聯(lián)苯胺顯色。洗滌后，將載玻片用100 g/L蘇木精復(fù)染1～2 min。

1.2.5 微血管密度（MVD）評估 腫瘤組織常規(guī)切片后，每組標(biāo)本各取一張壞死組織最少、腫瘤細(xì)胞豐富的切片，首先在低倍光學(xué)顯微鏡下尋找內(nèi)皮細(xì)胞染色（CD34標(biāo)記）最密集的10個區(qū)域（形成微血管最豐富的區(qū)域），然后在高倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織微血管數(shù)目。計算每個視野的數(shù)目，取平均值，即為每個高倍視野下的MVD。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測 收集各組小鼠腫瘤組織，以TRIzol法提取總蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，分別用VEGF-A的一抗和對應(yīng)的二抗孵育PVDF膜，隨后用電化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色。使用Image J軟件分析蛋白灰度值。分別計算觀察組和對照組VEGF-A的相對表達(dá)量，結(jié)果以VEGF-A灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測 使用凱基KGA 7062一步法TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布者，兩組間比較采用t檢驗(yàn);符合正態(tài)分布單個因素組間均值差比較采用單因素方差分析，兩兩多重組間比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 EC組織中AT1R和ACE1的mRNA和蛋白表達(dá)

RT-qPCR檢測的結(jié)果表明，與癌旁組織相比較，子宮內(nèi)膜癌組織中AT1R和ACE1的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，二者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.298、9.032，P<0.05）。見圖1A、B。蛋白免疫印跡檢測的結(jié)果表明，與對應(yīng)的癌旁組織相比較，子宮內(nèi)膜癌組織中AT1R和ACE1的相對蛋白水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=39.631、64.313，P<0.05）。見圖1C。提示AT1R和ACE1在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)。

2.2 ARB和ACEI作用不同時間對HEC-1-B細(xì)胞移植瘤生長的影響對照組HEC1-B細(xì)胞的相對增殖活性為1.000±0.004，ARB組為0.511±0.081，ACEI組為0.425±0.079，ARB組和ACEI組的細(xì)胞增殖活性均顯著低于對照組（t=10.444、12.591，P<0.05）。對照組隨著時間增加，腫瘤體積持續(xù)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=245.324，P<0.05）;ARB組隨著時間增加，腫瘤體積也增加，但是速度放緩，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=89.115，P<0.05）;ACEI組在不同時間點(diǎn)的腫瘤體積的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.264，P>0.05）。分別與21、28、35 d的對照組比，ARB組的腫瘤體積均降低（t=9.534～13.226，P均<0.05），ACEI組的腫瘤體積也均降低（t=11.798～12.503，P均<0.05）。而在7 d和14 d，ARB和ACEI對腫瘤體積的抑制作用不明顯（t=1.330、2.109，P均>0.05）。見圖2a。對照組、ARB組和ACEI組不同時間點(diǎn)的組內(nèi)體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.186～4.321，P均>0.05）。與對照組相比較，ARB組和ACEI組小鼠的體質(zhì)量在各個時間點(diǎn)（7、14、21、28、35 d）均無變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.072～2.676，P均>0.05）。見圖2b。

2.3 ARB和ACEI對EC移植瘤血管生成的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照組中腫瘤微血管增生明顯，而且ARB組和ACEI組的MVD均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.944、11.563，P<0.05）。見圖3A～C。與對照組比較，ARB組和ACEI組的VEGF-A表達(dá)均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.523、12.076，P<0.05）。見圖3D。

2.4 ARB和ACEI對EC移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，ARB組和ACEI組的腫瘤凋亡指數(shù)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.209、14.782，P<0.05）。見圖4。

3 討? 論

本文研究結(jié)果表明，ARB和ACEI在EC細(xì)胞小鼠異種移植模型中具有抗腫瘤作用。ARB（氯沙坦）和ACEI（卡托普利）的有效劑量和給藥方案均根據(jù)以往的研究和我們前期的研究結(jié)果而確定[8]。在本研究中，給藥后小鼠體質(zhì)量變化不顯著，表明ARB和ACEI的使用可能沒有引起較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。而且，從本研究結(jié)果來看，無論ARB或ACEI，二者對EC細(xì)胞移植瘤生長的抑制程度基本一致。另外，本研究結(jié)果顯示ARB和ACEI可能通過抑制小鼠EC細(xì)胞移植瘤的血管生成和促進(jìn)凋亡來抑制腫瘤的生長。

VEGF是調(diào)節(jié)血管生成的最重要的細(xì)胞因子。EC的關(guān)鍵特征是相對于正常子宮內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)上調(diào)[9]。VEGF是EC和其他多種癌癥的重要預(yù)后因素，而且藥物抑制腫瘤生長往往同時伴隨著VEGF表達(dá)的明顯降低[10]。MANENTI等[11]報道，順氯氨鉑可抑制人卵巢癌小鼠移植瘤模型中的腫瘤生長，并且與血漿中VEGF的顯著降低有關(guān)。本研究使用人EC細(xì)胞系HEC-1-B制備的移植瘤模型可以自發(fā)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括VEGF[12]，本研究中觀察到ARB和ACEI均能夠明顯抑制HEC-1-B移植瘤腫瘤標(biāo)本中VEGF的表達(dá)。

本文結(jié)果還顯示，ARB和ACEI可明顯抑制腫瘤血管生成。已知血管緊張素Ⅱ與血管緊張素轉(zhuǎn)移酶均和血管生成因子（包括VEGF）的分泌有關(guān)，并且血管緊張素Ⅱ受體的阻斷被認(rèn)為通過抑制VEGF分泌和血管生成來抑制腫瘤的生長[13]。多項(xiàng)研究證明，ARB和ACEI均能夠通過抑制VEGF對腎癌[14]、膀胱癌[15]、前列腺癌[16]等發(fā)揮抗血管生成作用。本文結(jié)果也表明，ARB和ACEI同樣可以抑制EC細(xì)胞移植瘤的血管新生，這與二者在多種腫瘤細(xì)胞移植瘤的血管新生過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用的報道一致[17-18]。然而，由于移植瘤模型的實(shí)驗(yàn)局限性，并不能明確人類VEGF在多大程度上可影響移植瘤中微血管的生成。

本文研究結(jié)果還表明，ARB和ACEI可以促進(jìn)EC細(xì)胞在體內(nèi)的凋亡。FUJIMOTO等[19]的研究結(jié)果顯示，ARB對胰腺癌具有抗增殖作用，ACEI對胃癌增殖也具有抑制作用[20]。TAN等[21]報道，氯沙坦能夠降低大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞增殖。本文結(jié)果則顯示，ARB和ACEI的抗腫瘤作用不僅表現(xiàn)為抗細(xì)胞增殖和抗血管生成，而且還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡。但其具體機(jī)制需要更深入的研究，并且應(yīng)該進(jìn)一步的研究ARB和ACEI的抗腫瘤侵襲性作用。

綜上所述，本文研究結(jié)果證明ARB和ACEI對EC腫瘤生長和血管生成均有潛在的抑制作用。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討靶向血管緊張素Ⅱ受體和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶對EC腫瘤治療作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（本文編輯 于國藝）