陳志軍 曹克鑫 朱德奇 甘紹印 王忠民

[摘要] 目的 探討HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）和微小RNA（miR）-613在食管鱗癌細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系及其對細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的影響。

方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測食管鱗癌細(xì)胞中HOTAIR和miR-613的表達(dá)情況，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HOTAIR和miR-613靶向關(guān)系，CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖和凋亡。

結(jié)果 與其他食管鱗癌細(xì)胞相比，人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)最高而且miR-613表達(dá)水平最低（F=48.56、56.28，P<0.05）。HOTAIR可靶向調(diào)控miR-613的表達(dá)。下調(diào)HOTAIR的表達(dá)明顯抑制了Eca-109細(xì)胞增殖，提高了細(xì)胞凋亡和miR-613表達(dá)水平（F=205.28～396.53，P<0.05）;抑制miR-613表達(dá)后，Eca-109細(xì)胞增殖能力明顯增強，而細(xì)胞凋亡能力明顯減弱（F=51.04、511.37，P<0.05）。

結(jié)論 下調(diào)HOTAIR可通過調(diào)控miR-613表達(dá)抑制食管鱗癌Eca-109細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 食管鱗狀細(xì)胞癌;HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA;RNA，長鏈非編碼;微RNAs;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R735.1;R342.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0736-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.171

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20211029.1732.002.html;2021-11-02 13：27：02

EFFECT OF THE EXPRESSION OF HOX TRANSCRIPT ANTISENSE INTERGENIC RNA AND MICRORNA-613 ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA CELLS

CHEN Zhijun， CAO Ke-

xin， ZHU Deqi， GAN Shaoyin， WANG Zhongmin

（Department? of Thoracic Surgery， The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， Xinxiang? 453100， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the regulatory role of HOX transcript antisense intergenic RNA （HOTAIR） and microRNA-613 （miR-613） in esophageal squamous cell carcinoma cells and their effect on cell proliferation and apoptosis.

Me-

thods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of HOTAIR and miR-613 in esophageal squamous cell carcinoma cells; dual luciferase reporter gene assay was used to detect the targeting relationship between HOTAIR and miR-613; CCK-8 assay and flow cytometry were used to measure cell proliferation and apoptosis.

Results Compared with other esophageal squamous cell carcinoma cell lines， the human esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 had the highest expression level of HOTAIR and the lowest expression level of miR-613 （F=48.56，56.28;P<0.05）. HOTAIR showed targeted regulation of miR-613 expression. Downregulation of HOTAIR expression significantly inhibited the proliferation of Eca-109 cells and increased cell apoptosis and the expression level of miR-613 （F=205.28-396.53，P<0.05）. After the expression of miR-613 was inhibited， Eca-109 cells showed a significant increase in proliferation and a significant reduction in apoptosis （F=51.04，511.37;P<0.05）.

Conclusion Downregulation of HOTAIR can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of Eca-109 cells by regulating the expression of miR-613.

[KEY WORDS] esophageal squamous cell carcinoma; HOX transcript antisense intergenic RNA; RNA， long noncoding; microRNAs; cell proliferation; apoptosis

食管癌是一種發(fā)病率和病死率均很高的消化道惡性腫瘤，其中腺癌和鱗狀細(xì)胞癌是常見的病理類型，而我國以食管鱗狀細(xì)胞癌最為常見。過去十幾年來，全球食管癌的發(fā)病率急劇升高[1]，而預(yù)計未來幾十年，其發(fā)病率還將持續(xù)升高，嚴(yán)重威脅著人類身體健康[2]。盡管手術(shù)切除、新輔助放化療等使食管癌病人的療效有所改善，但病人5年內(nèi)的總生存率仍然較低[1，3]。因此，為了更好地治療食管癌而深入研究其發(fā)病機制是十分必要的。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）是一種具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA（lncRNA），定位于hoxc基因座，全長2 158 nt，在多種實體瘤中異常高表達(dá)，通過與微小RNA（miRNA）的相互作用，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。HOTAIR在多種腫瘤中異常高表達(dá)并發(fā)揮著重要的促癌作用[5]，在食管鱗癌中HOTAIR參與了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等的調(diào)控[6]，但其在食管鱗癌中的作用機制尚不完全明確。miR-613是一類與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的短鏈非編碼RNA（NcRNA），被證實在喉鱗癌和胃癌等腫瘤中異常表達(dá)，并在癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。miR-613在食管鱗癌組織和血清中異常低表達(dá)，與病人腫瘤分期和預(yù)后不良密切相關(guān)[9]，但其在食管鱗癌中的作用并不清楚。本研究通過體外細(xì)胞實驗觀察HOTAIR和miR-613在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討了二者的相互作用關(guān)系及其在食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青鏈霉素雙抗和RPMI 1640培養(yǎng)基（加拿大Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測試劑盒（大連寶生物工程），miR-613 模擬物（mimics）、miR-613抑制劑（inhibitor）及模擬物對照（mimics-NC）、抑制劑對照（inhibitor-NC）和HOTAIR干擾序列si-HOTAIR（5′-CAUAUUA-

UAGAGUUGCUCUGUGCUG-3′）及其陰性對照si-NC（5′-GAGUAUGUGAGAUUAACUGGUGG-

C-3′）（上海吉瑪公司），Trizol試劑和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體3000（美國Invitrogen公司），膜聯(lián)蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（大連美侖生物公司），細(xì)胞計數(shù)（CCK-8法）試劑盒（上海碧云天生物公司），雙熒光素酶活性檢測試劑盒（上海澤葉生物公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞來源及其培養(yǎng) 人食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109和EC9706購于中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫，而人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE450購自上海雅吉生物公司。使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和RPMI 1640的培養(yǎng)基，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃和濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)Eca-109、EC9706和KYSE450細(xì)胞株，每2 d換液1次。待細(xì)胞貼壁80%～90%時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，并以1∶2比例傳代。選取長勢良好的第3代指數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 RT-qPCR方法檢測HOTAIR和miR-613的表達(dá) 向待測的食管鱗癌細(xì)胞株中加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后，使用紫外線分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，根據(jù)上海吉瑪公司合成的PCR引物，參照RT-qPCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴增，分別以GAPDH和U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法評價細(xì)胞中HOTAIR和miR-613表達(dá)水平。所用PCR引物及其序列見表1。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?本文為了驗證HOTAIR是否能與miR-613相結(jié)合，將HOTAIR基因的3′UTR克隆并重組至熒光素酶報告基因載體psiCHECK-2上，并以其作為HOTAIR的野生型（HOTAIR-WT），另將miR-613與HOTAIR基因的3′UTR結(jié)合位點進(jìn)行定點突變后克隆并重組至psiCHECK-2上，并以其作為HOTAIR突變型（HOTAIR-MUT）。按轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體3000說明書，將以250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的HOTAIR-WT/MUT質(zhì)粒（4.0 μg）、miR-613 mimics/mimics-NC（含量為100 pmol）與250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的脂質(zhì)體3000（10 μL）混勻后加入293T細(xì)胞，其中每個處理設(shè)3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，并參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ①HOTAIR基因影響Eca-109細(xì)胞增殖凋亡和miR-613表達(dá)的實驗：分為對照組（a組，未轉(zhuǎn)染）、si-NC組（b組，轉(zhuǎn)染si-NC）和si-HOTAIR組（c組，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR），每組設(shè)3個重復(fù)。②miR-613影響Eca-109細(xì)胞增殖凋亡實驗：分為si-HOTAIR組（a組，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR）、si-HOTAIR+inhibitor-NC組（b組，共轉(zhuǎn)染si-HOTAIR和inhibitor-NC）和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組（c組，共轉(zhuǎn)染si-HOTAIR和miR-613 inhibitor），每組設(shè)3個重復(fù)。將指數(shù)期Eca-109細(xì)胞以每孔4×105個接種至6孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合度時，根據(jù)實驗分組參照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體3000說明書步驟，將以250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的si-NC、si-HOTAIR、inhibitor-NC和miR-613 inhibitor（母液為20 μmol/L，1.56 μL）分別與250 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的脂質(zhì)體3000（10 μL）混合，混勻后加入到Eca-109細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞并采用RT-qPCR檢測細(xì)胞中HOTAIR和miR-613的表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組、si-HOTAIR組和未轉(zhuǎn)染的對照組以每孔105個接種至96孔細(xì)胞板上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待培養(yǎng)至所需時間12、24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液并參照CCK-8試劑盒說明書分別檢測各組細(xì)胞的光密度（OD）值。另外，轉(zhuǎn)染48 h后si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細(xì)胞的增殖活力檢測方法同上。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-NC組、si-HOTAIR組和未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞，分別以磷酸緩沖液洗滌3次后，參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞凋亡率。同時，采用相同方法檢測轉(zhuǎn)染48 h后si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，3組間均數(shù)的比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，3組間細(xì)胞增殖均數(shù)隨時間變化采用析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 HOTAIR和miR-613在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)

采用RT-qPCR檢測3種食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109、KYSE-450和EC9706中HOTAIR的相對表達(dá)水平。單因素方差分析結(jié)果顯示，3種細(xì)胞株HOTAIR的相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.28，P<0.05）;多重比較結(jié)果顯示，與KYSE-450細(xì)胞和EC9706細(xì)胞相比，HOTAIR在Eca-109細(xì)胞中的表達(dá)水平相對較高（P均<0.05）。單因素方差分析結(jié)果顯示，3種細(xì)胞株miR-613的相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=48.56，P<0.05）;多重比較結(jié)果顯示，miR-613在Eca-109細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯低于KYSE-450細(xì)胞和EC9706細(xì)胞（P均<0.05）。見圖1A、B。故選用Eca-109細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 HOTAIR和miR-613靶向關(guān)系的驗證

采用PicTar、miRanda、TargetScan和Microcosm Targets生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，HOTAIR和miR-613存在互補的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥臋z測結(jié)果顯示，與mimics-NC相比，miR-613 mimics可使轉(zhuǎn)染HOTAIR-WT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性降低（t=33.09，P<0.05），但對轉(zhuǎn)染HOTAIR-MUT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響（P>0.05）。見圖2A、B。

2.3 HOTAIR對食管鱗癌Eca-109細(xì)胞增殖凋亡和miR-613表達(dá)的影響

本文RT-qPCR的檢測結(jié)果顯示，在3組細(xì)胞中HOTAIR和miR-613表達(dá)整體比較有顯著差異（F=346.54、396.53，P<0.05），轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)水平明顯低于對照組（P<0.05），而miR-613的表達(dá)水平則明顯高于對照組（P<0.05），但轉(zhuǎn)染si-NC對HOTAIR和miR-613的表達(dá)無明顯影響（P>0.05）。見圖3A、E。CCK-8法檢測結(jié)果的析因設(shè)計方差分析顯示，F(xiàn)組別=26.58、P<0.05，F(xiàn)時間=40.62、P<0.05，F(xiàn)組別×?xí)r間=12.85、P<0.05;單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，作用12 h和24 h時間下，3組細(xì)胞的OD值差異無顯著性（P>0.05）;作用48 h和72 h時間下，3組細(xì)胞的OD值存在顯著差異（F=94.92、35.48，P<0.05）;轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 48、72 h后Eca-109細(xì)胞增殖活力較對照組明顯受到抑制（P<0.05），但轉(zhuǎn)染si-NC對Eca-109細(xì)胞增殖無明顯影響（P>0.05）。見圖3B。同時，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，3組細(xì)胞凋亡率之間存在著明顯差異（F=205.28，P<0.05）。與對照組相比，轉(zhuǎn)染si-NC后Eca-109細(xì)胞凋亡率無明顯變化（P>0.05），但轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 可使Eca-109細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。見圖3C、D。

2.4 miR-613對食管鱗癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

本文RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-613在si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor-NC組和si-HOTAIR+miR-613 inhibitor組細(xì)胞中的表達(dá)存在顯著差異（F=511.37，P<0.05）;轉(zhuǎn)染miR-613 inhibitor后Eca-109細(xì)胞中miR-613表達(dá)水平較si-HOTAIR組降低（P<0.05），而轉(zhuǎn)染inhibitor-NC后細(xì)胞中的miR-613表達(dá)與對照組比較則無明顯變化（P>0.05）。見圖4A。CCK-8法檢測結(jié)果的析因設(shè)計方差分析顯示，F(xiàn)組別=29.22、P<0.05，F(xiàn)時間=48.87、P<0.05，F(xiàn)組別×?xí)r間=16.74、P<0.05;單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染12 h和24 h后3組細(xì)胞的OD值無明顯差異（P>0.05）;作用48 h和72 h時間下，3組細(xì)胞的OD值存在顯著差異（F=66.74、59.64，P<0.05）;與si-HOTAIR組相比較，轉(zhuǎn)染miR-613 inhibitor 48 h后Eca-109細(xì)胞增殖活力明顯升高（P<0.05），而轉(zhuǎn)染inhibitor-NC對Eca-109細(xì)胞增殖活力無明顯影響（P>0.05）。見圖4B。另外，3組細(xì)胞凋亡率有顯著性差異（F=51.04，P<0.05）;轉(zhuǎn)染miR-613 inhibitor后Eca-109細(xì)胞凋亡率較si-HOTAIR組明顯降低（P<0.05），而轉(zhuǎn)染inhibitor-NC后其細(xì)胞凋亡率與si-HOTAIR組比較無顯著差異（P>0.05）。見圖4C、D。

3 討? 論

食管癌的發(fā)病機制十分復(fù)雜，與多種致癌基因和抑癌基因的異常改變和調(diào)控失調(diào)密切相關(guān)[10-11]。而人類大約有98%的DNA會轉(zhuǎn)錄成lncRNA和NcRNA[12]，其中l(wèi)ncRNA是一類長度超過200 nt的RNA，可通過與腫瘤相關(guān)的miRNA相互作用，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展;而miRNA是一類長度約為22 nt的NcRNA，可以通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮著重要作用;部分異常表達(dá)的lncRNA或miRNA在腫瘤中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用[13-14]。因此，深入研究lncRNA和miRNA在食管癌中的作用十分必要。

HOTAIR是首個被發(fā)現(xiàn)的有反式調(diào)控作用的lncRNA，可通過與甲基化酶復(fù)合體RPC2共同作用，調(diào)控與腫瘤相關(guān)的PTEN和p21等基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，被作為惡性腫瘤早期診斷、預(yù)后預(yù)測和基因治療的分子標(biāo)記物和潛在治療靶點[5]。HOTAIR在乳癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中異常高表達(dá)，可以通過調(diào)控miR-20a-5p、miR-143-3p和miR-203a-3p等的表達(dá)影響細(xì)胞增殖和凋亡等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15-17]。本研究通過轉(zhuǎn)染HOTAIR干擾序列成功下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)，結(jié)果顯示，Eca-109細(xì)胞增殖能力明顯減弱且細(xì)胞凋亡能力明顯增強。這與崔廣暉等[6]報道的干擾HOTAIR可抑制食管鱗癌EC9706細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的結(jié)果相吻合。該結(jié)果在另一種食管鱗癌Eca-109細(xì)胞中證實了HOTAIR的促癌作用。

miR-613在不同腫瘤組織中存在異常表達(dá)，且發(fā)揮的作用不盡相同。在宮頸癌中miR-613表達(dá)較鄰近正常組織高表達(dá)，而上調(diào)其表達(dá)可通過靶向調(diào)控酪氨酸蛋白磷酸酶非受體型9促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[18]。在骨肉瘤中miR-613表達(dá)下調(diào)，miR-613表達(dá)升高可通過直接抑制趨化因子受體4表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和誘導(dǎo)凋亡[19]。miR-613被證實在食管鱗癌中異常低表達(dá)，被認(rèn)為是食管鱗癌病人總生存率和無進(jìn)展生存率獨立預(yù)后因子[9]。有研究證實，HOTAIR可通過競

爭性吸附miR-613調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡等發(fā)揮促癌作用[20]。本研究先在生物信息學(xué)軟件中預(yù)測到HOTAIR和miR-613存在著互補的結(jié)合位點，兩者之間可能在食管鱗癌細(xì)胞中存在著相互作用關(guān)系;通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測證實miR-613可與HOTAIR 3′UTR靶向結(jié)合;同時，RT-qPCR檢測證實下調(diào)HOTAIR表達(dá)可引起食管鱗癌Eca-109細(xì)胞中miR-613表達(dá)升高;另外，轉(zhuǎn)染miR-613 inhibitor成功下調(diào)miR-613表達(dá)后明顯促進(jìn)了Eca-109細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。本文研究結(jié)果表明，在食管鱗癌中HOTAIR可靶向調(diào)控miR-613表達(dá)，低表達(dá)的miR-613可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HOTAIR可通過靶向調(diào)控miR-613在食管鱗癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，該結(jié)果進(jìn)一步豐富了HOTAIR促進(jìn)食管鱗癌惡性發(fā)展的分子機制，為HOTAIR有望成為靶向治療食管鱗癌的后續(xù)靶基因提供了新的參考依據(jù)。

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（本文編輯 于國藝）