趙志廉，陸玲玲，郭 曼，菅鳳國，付振鵬，劉明海

（昌邑市婦幼保健院病理科1，婦產(chǎn)科2，超聲科3，外科4，山東 昌邑 261300）

乳腺癌（breast cancer）是激素依賴性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)女性患病率最高的惡性腫瘤[1]。乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，嚴重威脅中國女性的生命健康。乳腺癌是育齡期女性癌癥導(dǎo)致死亡的首要原因[2]。育齡期女性由于其特殊的性質(zhì)，乳腺癌可嚴重影響其身心健康。目前乳腺癌的治療仍存在諸多問題，尤其對于妊娠期合并乳腺癌的治療，需要多學科聯(lián)合進行[3]。近半個世紀以來，世界各國的多項研究已證實，乳腺癌篩查是提高早期診斷率、患者生存率及生存質(zhì)量的最為有效的方法。世界衛(wèi)生組織已明確將早期乳腺癌列為可治愈性疾病，早期診斷早期治療是提高乳腺癌治愈率的最佳途徑[1]。尋找用于乳腺癌早期診斷和評估預(yù)后的新的臨床指標是癌癥研究的難題和熱點。腫瘤壞死因子-α-誘導(dǎo)蛋白8（TNFAIP8）家族又稱為TIPE 家族，包括TIPE、TIPE1、TIPE2 和TIPE3。人正常的TIPE2 可以表達于多種免疫細胞，參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。它也表達于多種非免疫細胞中，包括腦的神經(jīng)元細胞、肝細胞、食管鱗狀上皮細胞等[4]，這提示TIPE2 不僅參與免疫調(diào)節(jié)，還有其他的功能。研究指出[5-8]，TIPE2 在惡性腫瘤中出現(xiàn)異常表達。在乳腺癌、食管癌、胃癌、直腸腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)，TIPE2 在癌組織中明顯低表達。TIPE2 在上述腫瘤的生長過程中可能抑制腫瘤的發(fā)生，并且與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為呈負相關(guān)。本實驗通過免疫組織化學方法檢測育齡期女性乳腺癌組織中TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 的表達情況，并分析TIPE2、VEGF、βcatenin、cyclinD1 和各臨床病理參數(shù)之間的意義及TIPE2與VEGF、β-catenin、cyclinD1 之間的相關(guān)性，進一步探討TIPE2 在育齡期女性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取2012 年1 月-2017 年8 月昌邑市婦幼保健院病理科術(shù)前未行任何治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標本100例作為為實驗組，均為育齡期女性，年齡23～47歲，平均年齡（37.50±6.25）歲。術(shù)后常規(guī)病理診斷為浸潤性導(dǎo)管癌。同時隨機選取30例實驗組距離癌旁1 cm 的正常乳腺組織作為對照組。100例標本中，年齡≥37歲63例，＜37歲37例。不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ級9例，浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ、Ⅲ級91例；同時按照TNM分期標準進行分期，Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期35例。Ki-67 高表達者58例，Ki-67低表達者42例。ER 高表達者66例，ER 低表達者34例。PR 高表達者59例，PR 低表達者41例。Her-2 高表達者36例，HER-2 低表達者64例。腫瘤＞2 cm 者32例，≤2 cm 者68例。

1.2 免疫組化染色 所有切除的標本采用福爾馬林固定。TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50），均買自武漢三鷹生物科技有限公司。即用型ER、PR、HER-2、Ki-67 抗體買自福建邁新生物技術(shù)有限公司。所有乳腺癌蠟塊標本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師獨立確診。常規(guī)石蠟4 μm 切片，免疫組織組織化學方法采用SP 法。切片在70 ℃烤箱中烤2 h，經(jīng)過二甲苯、無水乙醇、梯度酒精、蒸餾水進行脫蠟水化，檸檬酸pH=6.0 高溫高壓修復(fù)4 min，然后滴上適當劑量的一抗工作液，放入濕盒中，并放于4 ℃冰箱過夜。經(jīng)PBS 溶液沖洗3 min，共3 次。加入二抗，37 ℃孵育30 min。滴加適量結(jié)合有辣根過氧化物酶的生物素試劑，然后用PBS 溶液沖洗。DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗，蘇木素染細胞核1 min左右，蒸餾水沖洗，PBS 返藍。用PBS 液替代一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標 比較不同年齡、TNM分期、浸潤程度、腫塊大小、Ki-67、ER、PR、HER-2 陽性表達患者的TIPE2、VEGF、β-catenin 和cyclinD1 表達情況，分析乳腺癌組織中TIPE2 的表達與VEGF、β-catenin、cyclinD1 的相關(guān)性。

1.4 結(jié)果判定 依據(jù)美國臨床腫瘤學會ASCO分級對TIPE2、VEGF、β -catenin、cyclinD1、ER、PR、HER -2、Ki-67 行結(jié)果判讀。TIPE2、VEGF 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞漿；ER、PR、Ki-67、cyclinD1 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞核；HER-2、β-catenin 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞膜。根據(jù)染色陽性的腫瘤細胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計數(shù)為0、1、2、3、4分。根據(jù)腫瘤細胞著色強度分別標記為-、+、++、+++，對應(yīng)計數(shù)為0、1、2、3分。得到的兩組數(shù)值相乘，＜8分判讀為低表達，≥8分判讀為高表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌中的表達 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌在顯微鏡下呈異常的導(dǎo)管癌細胞在纖維間質(zhì)中浸潤性生長，排列成腺樣結(jié)構(gòu)或?qū)嶓w團塊。TIPE2、VEGF 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞漿；ER、PR、Ki-67、cyclinD1 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞核；HER-2、β-catenin 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞膜。TIPE2 在乳育齡期女性腺癌組織中呈低表達，VEGF、β-catenin、cyclinD1 在育齡期女性乳腺癌組織中呈高表達，見圖1。

圖1 正常乳腺組織及乳腺癌免疫組化表達（×400）

2.2 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 TIPE2 在乳腺癌組織中呈低表達，低于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌組織中呈高表達，高于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌組織中的表達分別與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級、Ki-67 指數(shù)高相關(guān)（P＜0.05），但與ER、PR、HER-2的表達、腫瘤大小、年齡無關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 乳腺癌中TIPE2 表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 間的相關(guān)性TIPE2 的表達分別與VEGF（r=-0.326，P＜0.001）、β-catenin（r=-0.208，P＝0.019）、cyclinD1（r=-0.295，P＝0.002）的表達呈負相關(guān)。VEGF 的表達分別與β-catenin（r=0.349，P＜0.001）、cyclinD1（r=0.298，P＝0.001）的表達呈正相關(guān)，β-catenin 的表達與cyclinD1（r=0.285，P＝0.002）的表達呈正相關(guān)，見圖2。

圖2 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 之間的相關(guān)性

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，我國女性乳腺癌發(fā)病率和死亡率在全球處于比較低的水平，但近年來呈迅速增長的趨勢，尤其是農(nóng)村地區(qū)近10 年來上升趨勢明顯。育齡期乳腺癌在我國農(nóng)村發(fā)病率較高，早期缺乏明顯癥狀，易被漏診，治療效果較差[9]。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是當今醫(yī)學界研究的重點。

TIPE2 約21 kDa，是一種新發(fā)現(xiàn)的與caspase-8結(jié)合的天然免疫和適應(yīng)性免疫的負性免疫調(diào)節(jié)因子。TIPE2 在免疫組織和非免疫組織中均有表達，與caspase-8 的結(jié)合可抑制活化蛋白-1（AP-1）和核因子-κB（NF-κB）的活性，最終促進Fas 誘導(dǎo)的免疫細胞凋亡，從而參與機體的免疫穩(wěn)態(tài)[10]。在感染性和自身免疫性疾病患者中，TIPE2 顯著下調(diào)，TIPE2 的缺失導(dǎo)致嚴重的炎癥疾病。近年來，越來越多的證據(jù)表明TIPE2 是一種理想的生物標志物，在多種腫瘤類型中起到抑瘤作用[11]。TIPE2 的低表達與多種上皮源性惡性腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，包括結(jié)直腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、肺癌[5-8]。由此可見，TIPE2 在癌癥中作為一個抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可能作為評估預(yù)后的獨立指標。本實驗通過免疫組織化學方法結(jié)果進一步證明，TIPE2 在育齡期女性乳腺癌組織中呈現(xiàn)低表達，可能參與抑癌癌癥發(fā)展的過程。

對于TIPE2 在腫瘤中的作用機制，近年也有深入的研究。Wnt 信號通路在細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程中，以及在細胞癌變、腫瘤侵襲等病理過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。β-catenin 介導(dǎo)的信號通路是Wnt 信號傳導(dǎo)通路中的經(jīng)典信號通路，當Wnt 信號途徑被激活時，β-catenin 由于細胞分泌的Wnt 蛋白增多，影響β-catenin 的降解，大量沉積在胞質(zhì)中，后進入細胞核并與TCF 因子結(jié)合，從而促進Wnt 靶基因的表達，如c-Myc 和cyclinD1。CyclinD1 是β-catenin 重要的下游靶基因[12]。TIPE2 可能通過Wnt/β-catenin 信號通路促進人直腸腺癌細胞凋亡[8]。磷酯酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是調(diào)節(jié)細胞生存和增殖的重要因子。Akt/PKB 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為PI3 激酶的下游調(diào)節(jié)因子，是目前公認的調(diào)節(jié)細胞細胞凋亡重要的途徑。TIPE2 過表達可通過抑制PI3K/Akt 信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲[13]。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種分子量約為45 kDa 的同二聚糖蛋白，是新生血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)。VEGF 是腫瘤血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，其表達受癌基因表達、多種生長因子及缺氧等因素的上調(diào)。血管生成對癌癥的發(fā)展和生長至關(guān)重要，VEGF 作用下形成的腫瘤血管在結(jié)構(gòu)和功能上都有異常，如血管形狀不規(guī)則，彎曲，有盲端，不形成小靜脈、小動脈和毛細血管，也有滲漏和出血，導(dǎo)致間質(zhì)高壓。這些特點意味著腫瘤血流不理想，導(dǎo)致缺氧，進一步產(chǎn)生VEGF。VEGF 在腫瘤血管生成中的中心作用使其成為抗腫瘤治療的合理靶點[14-16]。特異性短干擾RNA敲除TIPE2 可提高TNF-α、IL-1β 和VEGF 的表達水平，特別是在脂多糖刺激下?？紤]到血管內(nèi)皮生長因子在新生血管最后階段的重要作用，抗炎TIPE2也具有抗血管生成作用[17]。在肺癌的發(fā)生發(fā)展研究機制中發(fā)現(xiàn)[18]，TIPE2 通過抑制Rac1 的激活，進而減弱其下游效應(yīng)，包括F-actin 聚合和VEGF 表達，從而抑制腫瘤的侵襲性和血管生成。

本實驗發(fā)現(xiàn)，TIPE2 在育齡期女性乳腺癌組織中的表達低于周圍正常乳腺組織，而VEGF、βcatenin、cyclinD1 在育齡期女性乳腺癌組織中的表達高于周圍正常乳腺組織。同時，TIPE2、VEGF、βcatenin、cyclinD1 的異常表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期、Ki-67 高表達臨床病理參數(shù)相關(guān)，表明TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在一定程度上作用于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)性分析顯示，乳腺癌中TIPE2 的表達分別與VEGF、β-catenin、cyclinD1的表達呈負相關(guān)，VEGF與β-catenin、cyclinD1 的表達呈正相關(guān)，而β-catenin 的表達與cyclinD1 的表達也呈正相關(guān)。這說明TIPE2 在乳腺癌中的作用機制與VEGF、β-catenin 和cyclinD1 的表達相關(guān)，可以推斷KPNA2 通過Wnt 通路和VEGF 介導(dǎo)的血管形成作用于乳腺癌的侵襲發(fā)展過程。

乳腺癌現(xiàn)在的治療主要通過傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療。這對于育齡期女性的身心健康影響重大。如能及時發(fā)現(xiàn)并確診，并給予合理的治療，可提高育齡期乳腺癌患者的生存率及生存質(zhì)量[19，20]，因此需要進一步尋找新的用于臨床治療的基因靶點。

綜上所述，在育齡期女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，TIPE2 的低表達與多種臨床病理特征相關(guān)，TIPE2可能成為一個重要的靶點分子，通過Wnt 通路和VEGF 介導(dǎo)的血管形成過程從而影響乳腺癌的侵襲發(fā)展。但Wnt 通路如何調(diào)控VEGF 的作用，還需要進一步研究。后續(xù)研究方向是通過更復(fù)雜的體內(nèi)外實驗明確TIPE2 在乳腺癌中與Wnt 通路和VEGF之間的作用機制，構(gòu)建TIPE2 參與細胞信號通路的模型，利于對育齡期女性乳腺癌的評估和臨床治療提供新的研究方向。