賈秀鵬，蒙伶俐，李海莉，陳 潔，陳佳意

（寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波 315000）

乳腺癌（breast cancer）是一種常見的惡性腫瘤[1-3]，是全球婦女癌癥相關(guān)死亡的第一大原因。目前，對于乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍知之甚少，主要是惡性腫瘤侵犯破壞乳腺正常組織并通過淋巴管、血道，引起局部或全身復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。臨床常用的乳腺癌治療方法包括化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、曲妥珠單抗靶向治療、免疫治療及放射治療等。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前被公認(rèn)的臨床治療效果最差，爭議最多的一種亞型[4]。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）均為腫瘤免疫檢查點(diǎn)，在人類免疫調(diào)節(jié)途徑中起著重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/ PD-L1 在腫瘤組織中可通過傳遞抑制性信號，引起腫瘤特異性T 細(xì)胞無法活化，從而不能將腫瘤細(xì)胞殺死，最終可導(dǎo)致抗腫瘤免疫降低甚至失效。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)OXP3）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞獨(dú)立的標(biāo)記物，可通過誘導(dǎo)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)功能，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫逃逸[4]。目前，PD-1、PD-L1、FOXP3 已被報(bào)道在食管鱗狀細(xì)胞癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中存在高水平表達(dá)，并被證實(shí)與患者臨床病理特征密切相關(guān)，然而，其在乳腺癌中報(bào)道尚不多見，尤其在三陰性乳腺癌的相關(guān)研究者報(bào)道甚少。本研究通過測定70例三陰性乳腺癌，30例非三陰性乳腺癌患者組織中PD-1、PD-L1、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞FOXP3的表達(dá)情況，探討其與三陰性乳腺癌患者臨床病理特征間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月-2020 年1 月經(jīng)寧波市臨床病理診斷中心診斷的70例三陰性乳腺癌，30例非三陰性乳腺癌患者為研究對象。100例乳腺癌患者中組織學(xué)分級Ⅰ、Ⅱ級者35例、Ⅲ級者65例；淋巴血管侵犯者38例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。本研究經(jīng)中心倫理委員會批準(zhǔn)，取得患者知情同意并簽署同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡18～65歲；②經(jīng)手術(shù)切除治療；③術(shù)前未接受過放療、化療；④臨床資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并其他惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 方法 采用免疫組化法測定組織中PD-1、PDL1、FOXP3 的表達(dá)。組織制成厚度為4 μm 的連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，所有免疫組化均在Leica BOND-MAX 全自動免疫組織化學(xué)儀上操作。DAB顯色，以蘇木精輕度復(fù)染；分別以已知陽性扁桃體組織作為陽性對照、PBS 代替一抗作為陰性對照；其中鼠抗人PD-1、鼠抗人FOXP3、兔抗人CD3 單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人PD-L1 多克隆抗體（克隆號SP142）購自英國Abcam 公司。免疫組織化學(xué)結(jié)果均由2名高年資乳腺病理?？漆t(yī)師進(jìn)行雙盲獨(dú)立閱片。ER/PR 判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2020 年美國臨床腫瘤學(xué)會/美國病理醫(yī)師學(xué)院（ASCO/CAP）判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，ER 和PR 胞核陽性細(xì)胞≥1%判定為陽性。HER2 判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2019 年中國乳腺癌HER2 檢測指南[8]，0～1＋表示陰性，3＋表示陽性，2＋則進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測，如HER2 基因無擴(kuò)增則為陰性。PD-L1 以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性。PD-L1 以陽性細(xì)胞數(shù)≥1%判為陽性，＜1%判為陰性[9]，分別評價(jià)腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）中PD-L1的表達(dá)情況。PD-1 表達(dá)于間質(zhì)TIL，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃至棕褐色為陽性。以陽性細(xì)胞數(shù)≥5%判為陽性，＜5%判為陰性[9]，F(xiàn)OXP3 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：FOXP3陽性物為黃色或棕黃色顆粒，定位于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)[10]。

1.4 觀察指標(biāo) ①比較三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3 陽性表達(dá)情況；②比較不同年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、淋巴血管侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者乳腺癌組織中腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）PD-1、PD-L1、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞FOXP3 陽性表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，比較采用χ2分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1、FOXP3 表達(dá)情況比較 三陰性乳腺癌組織中腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）中PD-1、PD-L1、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞FOXP3陽性表達(dá)率均高于非三陰性乳腺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

圖1 免疫組化法測定PD-1、PD-L1、FOXP3 蛋白表達(dá)（×400）

表1 三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3 陽性率比較[n（%）]

2.2 三陰性乳腺癌組織中間質(zhì)TIL PD-1 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系 三陰性乳腺癌組織中間質(zhì)TILPD-1 陽性表達(dá)率與患者年齡、腫瘤直徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織學(xué)分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者三陰性乳腺癌組織中間質(zhì)TILPD-1 陽性表達(dá)率分別高于組織學(xué)分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管侵犯及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三陰性乳腺癌組織中間質(zhì)TILPD-1 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 三陰性乳腺癌組織中PD-L1 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系 三陰性乳腺癌組織中腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)TIL 中PD-L1 陽性表達(dá)率與患者年齡、腫瘤直徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織學(xué)分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者三陰性乳腺癌組織腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)TIL 中PD-L1陽性表達(dá)率分別高于組織學(xué)分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管間隙侵犯及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三陰性乳腺癌組織中PD-L1 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.4 三陰性乳腺癌組織中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞FOXP3 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系 三陰性乳腺癌組織中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞FOXP3 陽性表達(dá)率與患者年齡、腫瘤直徑及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織學(xué)分級為Ⅲ級、淋巴血管侵犯患者三陰性乳腺癌組織中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞FOXP3 陽性表達(dá)率分別高于組織學(xué)分級為Ⅰ、Ⅱ級、無淋巴血管侵犯患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 三陰性乳腺癌組織中FOXP3 陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

3 討論

PD-L1 又稱為B7 同源體1（B7 homolog 1，B7-H1），是通過人類基因庫進(jìn)行B7-1、B7-2 同源性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的。人PD-L1 基因定位于染色體9p24.2，cDNA 全長873bp[10，11]。PD-L1 mRNA 在許多組織中可以檢測到，在心臟、胎盤、肺臟和骨骼肌表達(dá)較高，在胸腺、肝臟、脾臟和腎臟呈低水平表達(dá)。免疫組織化學(xué)法研究表明PD-L1 蛋白的表達(dá)在正常組織中僅局限于巨噬系統(tǒng)來源的細(xì)胞，如肝臟的Kupffer 細(xì)胞，肺臟的巨噬細(xì)胞，扁桃體副皮質(zhì)區(qū)的組織細(xì)胞等。而在人類肺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、惡性腦腫瘤、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌等許多腫瘤組織中都可檢測到PD-L1 的表達(dá)。有些不表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞在IFN-γ 刺激后可誘導(dǎo)其表達(dá)。PD-1是PD-L1 的受體[12-14]。PD-1、PD-L1 均為腫瘤免疫檢查點(diǎn)，在人類免疫調(diào)節(jié)途徑中起著重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/PD-L1 在腫瘤組織中可通過傳遞抑制性信號，引起腫瘤特異性T 細(xì)胞無法活化，從而不能將腫瘤細(xì)胞殺死，最終可導(dǎo)致抗腫瘤免疫降低甚至失效。

PD-L1 在多種實(shí)體腫瘤組織中的異常高表達(dá)近年來引起廣泛的關(guān)注，并且在結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、宮頸癌中的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。隋啟海等[5]以食管鱗狀細(xì)胞癌患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織中PD-1、PD-L1 表達(dá)水平存在顯著差異，且PD-1、PD-L1 水平與腫瘤T分期相關(guān)；吳菡等[6]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者PD-1 及PD-L1的mRNA 和蛋白均存在高度表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤直徑、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測了PD-L1、PD-1分子在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)情況，分析與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌癌組織中PD-1、PD-L1 陽性表達(dá)率顯著高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1 陽性表達(dá)率與患者高組織學(xué)級別、淋巴血管侵犯以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，與既往研究結(jié)論一致，提示PD-1/PD-L1 通路激活促進(jìn)了腫瘤發(fā)生免疫逃逸，起到了免疫負(fù)調(diào)控的作用，其可能通過多種機(jī)制參與了腫瘤的進(jìn)展。以PD-1/PD-L1 靶點(diǎn)為代表的腫瘤免疫治療為三陰性乳腺癌患者帶來了新的希望，其靶向藥可能會進(jìn)入TNBC 患者的治療方案。

越來越多的研究表明，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)起著不容忽視的重要作用。機(jī)體組織正常狀態(tài)下少有免疫細(xì)胞浸潤，但是在發(fā)生腫瘤時(shí)卻出現(xiàn)大量的免疫細(xì)胞浸潤。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs），雖然不能直接識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，但其對抗體的生成以及腫瘤殺傷細(xì)胞的活化具有輔助、放大效應(yīng)[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[16，17]，除PD1 及其配體PD-L1 外，F(xiàn)OXP3 同樣能夠阻礙機(jī)體的免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視，為腫瘤細(xì)胞免疫逃逸提供有力環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Hou J 等[18]和蘇偉[19]以胃癌和結(jié)腸癌患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)FOXP3 表達(dá)與腫瘤分期及分化程度相關(guān)。Zhang H等[20]研究顯示，宮頸癌組織中存在FOXP3 的高度表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者高組織學(xué)級別顯著相關(guān)。Zhang L 等[21]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中FOXP3+Treg細(xì)胞的分布方式和數(shù)量不同，并且與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞FOXP3 陽性表達(dá)率高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），且與高組織學(xué)級別、淋巴血管侵犯情況相關(guān)，與既往研究結(jié)論一致，由此推斷在乳腺局部微環(huán)境中，負(fù)性因子FOXP3 的免疫抑制作用增強(qiáng)，并且此種免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用是隨著腫瘤惡性分化程度的加重而加劇的。

綜上所述，三陰性乳腺癌患者癌組織中存在PD-1、PD-L1、調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞FOXP3 的高表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌患者高組織學(xué)級別、浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，當(dāng)然，尚需大宗病例深入的研究來證實(shí)PD-1/PD-L1 作為TNBC 生物標(biāo)志物的可行性，甚至制定出三陰性乳腺癌PD-1/PD-L1 檢測指南來篩選適合的患者進(jìn)行腫瘤免疫治療。