李鴻浩, 徐 超, 林智慧, 顧 鋼, 周 挺, 梁頒捷, 陳承亮, 石 妍, 劉國(guó)坤, 肖 順

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省煙草公司三明市公司，福建 三明 365000；3.福建省煙草公司煙草科學(xué)研究所，福建 福州 350003)

福建省是我國(guó)重要植煙區(qū).鄧真等[1]于2009—2011年對(duì)福建省煙區(qū)病害進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草灰霉病在各煙區(qū)普遍發(fā)生，個(gè)別地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，其病原菌為害煙株的莖、葉和花器，對(duì)煙草產(chǎn)量及品質(zhì)均造成影響.據(jù)三明煙草公司統(tǒng)計(jì)，僅2015年三明煙區(qū)發(fā)生灰霉病的面積就達(dá)5.64 hm2，累計(jì)產(chǎn)量損失約1.5×106kg.

目前，對(duì)于灰霉病的防治主要依賴于化學(xué)藥劑.許多學(xué)者對(duì)不同類型藥劑對(duì)煙草灰霉病的防治效果進(jìn)行了研究.例如：宮飛燕等[2]研究發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺、多氧霉素、異菌脲、多菌靈、腐霉利、乙烯菌核利、嘧霉胺和代森錳鋅對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的有效抑制中濃度(EC50)值分別為0.03、2.21、3.48、6.79、23.21、24.74、34.94和621.36 mg·L-1；周浩等[3]研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈、丙環(huán)唑、嘧霉胺和異菌脲對(duì)4株煙草灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50平均值分別為0.06、0.36、0.53和0.60 mg·L-1；汪漢成等[4]研究發(fā)現(xiàn)，氟啶胺、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和代森錳鋅對(duì)煙草灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值分別為0.02、0.03、0.39和7.86 mg·L-1.由此可見，不同研究中相同藥劑對(duì)煙草灰霉病菌的抑制作用存在一定差異，這可能與菌株不同有關(guān).

腐霉利和異菌脲屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，是生產(chǎn)中用于防治灰霉病的重要?dú)⒕鷦秽酌拱穼儆诒桨被奏ゎ悮⒕鷦?，?duì)灰霉病具有特效[5-7].本研究從福建省6個(gè)煙區(qū)采集灰霉病樣品，經(jīng)分離鑒定后，選擇30株菌株作為供試菌株，檢測(cè)其對(duì)腐霉利、異菌脲及嘧霉胺的敏感性，以明確這些藥劑對(duì)福建省煙區(qū)灰霉病菌的抑制作用，為今后煙區(qū)合理用藥提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

煙草灰霉病樣品：2016年4—5月采集于福建省6個(gè)植煙區(qū)煙草站，包括泰寧縣下渠煙草站、沙縣富口村煙草站、建寧縣煙草站、清流縣煙草站、大田縣太華鎮(zhèn)萬湖村煙草站及永安市大湖煙草站，每個(gè)站點(diǎn)隨機(jī)采集發(fā)病葉片10片.

分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基，制備方法參考文獻(xiàn)[8].

殺菌劑：腐霉利[procymidone，50%水分散粒劑，興農(nóng)藥業(yè)(中國(guó))有限公司]，異菌脲[iprodione，500 g·L-1懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司]，嘧霉胺(pyrimethanil，50%可濕性粉劑，壽光晨陽農(nóng)化有限公司).所有藥劑用無菌水配成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的母液備用.

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 采用組織分離法[8]分離菌株：取病健交界處小塊組織于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中浸泡2 s，然后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液再次消毒10 min，無菌水漂洗3次，再用無菌濾紙吸去表面水分后接于PDA平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，挑取新鮮菌絲培養(yǎng)直至純化.每個(gè)采集地隨機(jī)選擇5株菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察 將分離到的30株菌株接種于PDA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，記錄菌落與菌核的顏色和形態(tài).在光學(xué)顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ni-U)和體式顯微鏡(Nikon SMZ18)下觀察病原菌分生孢子梗及孢子形態(tài)特征并拍照.

1.2.3 病原菌分子鑒定 收集0.5～1.0 g菌絲于2 mL離心管中，蓋緊后投入液氮中快速冷卻1 min，取出離心管并用研磨棒粉碎菌絲，然后根據(jù)Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取.

以表1的引物擴(kuò)增目的基因.ITS區(qū)PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[9]. HSP60、RPB2基因PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應(yīng)[10].擴(kuò)增G3PDH基因的退火溫度為64 ℃，其他程序同HSP60、RPB2序列的擴(kuò)增.所有PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 9.5 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板 1 μL，PremixTaqTM(TAKARA)12.5 μL.引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.反應(yīng)完成后，取4 μL PCR產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè).將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，采用軟件DNAMAN 7.0 (Lynnon BioSoft,魁北克,加拿大) 對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)拼接，最后將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中進(jìn)行對(duì)比鑒定.

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物[10-11]Table 1 Primers for PCR amplification and sequencing

1.2.4 藥劑敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定30株菌株對(duì)殺菌劑腐霉利、異菌脲和嘧霉胺的敏感性.在菌落邊緣打取菌餅(?=50 mm)，分別接種于含不同濃度藥劑的PDA平板上，以不含藥劑的PDA平板為對(duì)照，每個(gè)處理4次重復(fù).將所有接種平板置于23 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，待對(duì)照菌落直徑約為培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量各濃度處理的菌落直徑，計(jì)算各濃度藥劑對(duì)菌株生長(zhǎng)的抑制率.試驗(yàn)中腐霉利的終濃度分別為0.010、0.025、0.030、0.050和0.100 μg·mL-1；異菌脲的終濃度分別為0.04、0.05、0.07、0.10和0.20 μg·mL-1；嘧霉胺的終濃度分別為0.047、0.056、0.070、0.090和0.140 μg·mL-1.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2016和DPS V7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草灰霉病病原菌形態(tài)特征

所有菌株的菌絲和菌落形態(tài)均相似：菌絲在生長(zhǎng)初期為無色或淺色，生長(zhǎng)中后期顏色加深，為淺褐色或深褐色；菌落生長(zhǎng)初期均為灰白色，且多數(shù)菌落呈棉絮狀或匍匐狀，后期氣生菌絲較發(fā)達(dá)且致密(圖1A)；分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)、直立，具分隔且有分枝，分生孢子梗底部略微膨大，頂端的產(chǎn)孢細(xì)胞膨大呈球狀，其上生長(zhǎng)小柄并產(chǎn)生大量分生孢子，呈葡萄穗狀，分生孢子為單細(xì)胞，呈卵圓形，長(zhǎng) 7.17～10.23 μm，平均(8.44±0.75) μm，寬5.21～6.31 μm，平均(5.75±0.34) μm(圖1B，1C)；培養(yǎng)7 d后，菌落開始產(chǎn)生菌核(圖1D)，菌核初期呈白色，后顏色逐漸加深，變黑變硬.由此初步判斷該病原菌為灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.).

A.菌落;B.分生孢子;C.孢子梗;D.菌核.圖1 煙草灰霉病病原菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of tobacco gray mold pathogen

2.2 rDNA-ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)30株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得約540 bp的片段.測(cè)序后將所有序列于NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，30株菌株與灰葡萄孢的同源性在97.35%～99.63%之間.選取其中同源性最高(99.63%)的一個(gè)序列上傳，該序列名稱為fafu01，登錄號(hào)為MW629853.1. RPB2、G3PDH、HSP60基因擴(kuò)增分別獲得約1 100、900、1 000 bp的片段，與目的片段大小一致.綜合病原菌形態(tài)特征及ITS序列比對(duì)結(jié)果，可確定本研究分離的煙草灰霉病病原菌均為灰葡萄孢.

2.3 30株菌株對(duì)腐霉利的敏感性

供試的30株灰霉病菌菌株對(duì)腐霉利的敏感性無顯著差異，其EC50平均值在0.73～1.11 μg·mL-1之間.不同植煙區(qū)的菌株對(duì)腐霉利的敏感性差異倍數(shù)有所不同：來自大田縣的菌株差異最大，差異倍數(shù)為5.44；其他采集地的菌株差異倍數(shù)均小于2.00 .敏感性最低和最高的菌株均來自大田縣(表2).

表2 不同植煙區(qū)煙草灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性1)Table 2 Sensitivity of B.cinerea collected from different planting regions to procymidone

1)差異倍數(shù)為EC50最大值與最小值的比值.

2.4 30株菌株對(duì)異菌脲的敏感性

供試的30株菌株對(duì)異菌脲的敏感性無顯著差異，其EC50平均值在0.41～1.01 μg·mL-1之間.不同植煙區(qū)的菌株對(duì)異菌脲的敏感性差異有所不同：來自大田縣的菌株差異最大，差異倍數(shù)為3.17；來自沙縣的菌株次之，差異倍數(shù)為2.49；其他采集地的菌株差異倍數(shù)均小于2.00.敏感性最低的菌株來自沙縣和清流縣，敏感性最高的菌株來自大田縣(表3).

表3 不同植煙區(qū)煙草灰霉病菌對(duì)異菌脲的敏感性1)Table 3 Sensitivity of B.cinerea collected from different planting regions to iprodione

2.5 30株菌株對(duì)嘧霉胺的敏感性

供試的30株菌株對(duì)嘧霉胺的敏感性無顯著差異，其EC50平均值在0.77～1.18 μg·mL-1之間.不同植煙區(qū)的菌株對(duì)嘧霉胺的敏感性差異有所不同：來自泰寧縣的菌株差異最大，差異倍數(shù)為3.55；來自大田縣的菌株次之，差異倍數(shù)為3.17；其他采集地的菌株差異倍數(shù)均小于3.00.敏感性最低的菌株來自建寧縣和永安市，敏感性最高的菌株來自泰寧縣(表4).

表4 不同植煙區(qū)煙草灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的敏感性1)Table 4 Sensitivity of B.cinerea collected from different planting regions to pyrimethanil

3 討論

本研究對(duì)福建省6個(gè)植煙區(qū)的煙草灰霉病病原菌進(jìn)行了分離，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)其中30株菌株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明所有菌株均為灰葡萄孢.

腐霉利對(duì)30株煙草灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值范圍為0.38～2.06 μg·mL-1.已有研究表明，腐霉利對(duì)來自草莓和藍(lán)莓的灰霉菌菌株的EC50值為0.07～5.76 μg·mL-1[13].可見，腐霉利對(duì)不同灰霉菌菌株的EC50值差異很大.

異菌脲對(duì)30株煙草灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值范圍為0.23～1.17 μg·mL-1.Avenot et al[14]通過對(duì)來自葡萄、開心果和石榴的灰霉病菌進(jìn)行研究認(rèn)為，當(dāng)異菌脲對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC50值小于1 μg·mL-1時(shí)，菌株為敏感菌株；Baggio et al[15]研究表明，當(dāng)異菌脲對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值大于1.2 μg·mL-1時(shí)，菌株為抗性菌株；Chen et al[16]研究也表明，異菌脲對(duì)黑莓灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值為2.596 μg·mL-1，其對(duì)灰霉病的防效大幅降低.由此推測(cè)福建煙草灰霉病菌可能有部分菌株出現(xiàn)了一定抗性，但抗性比較低.

嘧霉胺對(duì)30株煙草灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值范圍為0.33～1.22 μg·mL-1.已有研究表明，當(dāng)嘧霉胺對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值大于5.0 μg·mL-1時(shí)，菌株為抗性菌株[15].由此推測(cè)本研究中的供試菌株尚未對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗性.

綜上所述， 3種藥劑對(duì)30株煙草灰霉病菌菌株的抑制效果都比較好，但從EC50平均值來看，效果最好的是異菌脲(0.71 μg·mL-1)，腐霉利(0.91 μg·mL-1)次之.

致謝：感謝福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陳鳳平博士在論文寫作過程中給予的幫助！