梁成剛, 韋春玉, 汪 燕, 關(guān)志秀, 鄧 嬌, 黃 娟, 石桃雄
(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心,貴州 貴陽(yáng) 550001)
植物早期脫水響應(yīng)蛋白(early responsive to dehydration,ERD)包含糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1]、泛素[2]、熱激蛋白[2]、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶[3]、ATP依賴型蛋白酶調(diào)節(jié)亞基等[4].Kiyosue et al[2]通過(guò)水分脅迫,在擬南芥中篩選到26個(gè)AtERDs克隆,并利用southern雜交將其歸為16組.劉松濤等[5]則基于干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定到5個(gè)ZmERD基因.植物ERD家族蛋白功能較為廣泛,是逆境脅迫快速響應(yīng)因子,具有調(diào)節(jié)逆境耐受性的重要作用.例如,ERD1為ClpA同源蛋白,受脫水快速誘導(dǎo)[4].ZmERD3蛋白在鹽脅迫與干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中起重要作用[6].同樣,擬南芥AtERD4蛋白在鹽脅迫和干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[7-8].擬南芥AtERD6蛋白為糖轉(zhuǎn)移載體,受脫水快速誘導(dǎo),在干旱脅迫中發(fā)揮作用[1].大豆GmERD15為轉(zhuǎn)錄因子,可在滲透脅迫下激活NRP-B表達(dá),進(jìn)而在細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用[9].玉米ZmERD16為泛素延伸蛋白,ZmERD16啟動(dòng)區(qū)域具有多個(gè)干旱、病害、光、激素等脅迫應(yīng)答元件[10].
苦蕎(Fagopyrumtararicum)是我國(guó)重要的雜糧作物,主要種植于中國(guó)西南的高寒山區(qū)[11].苦蕎主產(chǎn)區(qū)土壤貧瘠,干旱頻繁發(fā)生,在這種特殊的生長(zhǎng)環(huán)境中,苦蕎具備了較強(qiáng)的耐貧瘠、耐干旱、耐冷涼等優(yōu)良特性[12].糖類對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育乃至逆境響應(yīng)與耐受性等具有至關(guān)重要的作用[13].近年來(lái)調(diào)控打破糖類運(yùn)輸與分配的瓶頸在作物改良中取得了重要進(jìn)展[14].植物ERD蛋白中ERD6則通過(guò)調(diào)控糖的跨膜運(yùn)輸參與干旱等逆境脅迫的快速響應(yīng).目前,對(duì)作物ERD蛋白的研究工作開展相對(duì)較少,僅在少數(shù)模式作物中有報(bào)道[5,10].本試驗(yàn)首次對(duì)苦蕎FtERD家族中糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)行篩選、鑒定與生物信息學(xué)分析,明確FtERD糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的分類、蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析苦蕎FtERD糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)模式等,為苦蕎FtERD基因功能研究提供依據(jù).
登錄擬南芥TAIR基因庫(kù)網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp),下載AtERDs基因序列.利用苦蕎基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù),基于基因功能注釋與AtERDs同源序列分析,篩選苦蕎FtERDs基因.通過(guò)分析同源基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步篩選鑒定苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERD基因.
試驗(yàn)選用苦蕎品種晉蕎麥2號(hào)為材料,在光照培養(yǎng)箱(20 ℃、25 ℃)中進(jìn)行水培種植.出苗后10 d進(jìn)行15% PEG模擬干旱處理,以不施PEG為對(duì)照,其余栽培管理措施保持一致.處理后8 h對(duì)PEG處理與對(duì)照中植株進(jìn)行取樣,迅速放于液氮中,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存,供基因表達(dá)分析.
利用網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件,進(jìn)行苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)及編碼氨基酸序列查詢.利用網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件,進(jìn)行ORF編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè).利用網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件,進(jìn)行ORF編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸指數(shù)和疏水性預(yù)測(cè).利用MEGA 5.0軟件Cluster W進(jìn)行多重序列分析,Neighbor-joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,重復(fù)次數(shù)5 000次.
基于苦蕎出苗后5、10、15 d幼苗莖的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選差異表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因.利用MeV和SPSS 19.0軟件進(jìn)行基因的表達(dá)熱圖與相關(guān)性分析.參考RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒(DP452)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02)的操作步驟進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成.利用表1中引物進(jìn)行qRT-PCR基因定量表達(dá)檢測(cè).具體程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán).
表1 qRT-PCR基因表達(dá)的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR of gene expression
基于苦蕎基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行FtERDs基因的篩選,結(jié)果篩選出49個(gè)FtERDs基因,根據(jù)基因注釋與擬南芥同源基因比對(duì),鑒定出28個(gè)苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因(表2).苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因序長(zhǎng)度為2 571~8 174 bp,其中,ORF編碼蛋白FtERDs的氨基酸序列數(shù)為66~504個(gè),分子質(zhì)量為7 532.01~54 665.75 u,理論等電點(diǎn)為4.48~11.77,脂肪族氨基酸指數(shù)為36.67~143.46,疏水性為-1.425~1.292.蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)19個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs蛋白序列具有跨膜結(jié)構(gòu)域,其中,F(xiàn)tPinG50564.01、FtPinG71941.01、FtPinG17078.01蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域達(dá)到6個(gè),F(xiàn)tPinG00207.01、FtPinG50576.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01、FtPinG85532.01蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域達(dá)到12個(gè)以上.
表2 苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因序列分析Table 2 Sequencing analysis of sugar transporter gene FtERDs in Tartary buckwheat
利用擬南芥AtERDs序列與FtERDs基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果表明,28個(gè)苦蕎FtERDs基因與擬南芥AtERDs基因可被聚為4類,類Ⅰ包括13個(gè)苦蕎FtERDs基因,類Ⅱ包括9個(gè)苦蕎FtERDs基因,類Ⅲ包括1個(gè)苦蕎FtERD基因,類Ⅳ包括5個(gè)苦蕎FtERDs基因.其中,F(xiàn)tPinG34458.01和FtPinG66513.01與擬南芥At5G18840聚為一類;FtPinG17078.01與擬南芥At3G54510聚為一類;FtPinG46455.01和FtPinG46451.01與擬南芥At1G54730聚為一類;FtPinG63108.01與擬南芥At4G35870聚為一類(圖1).
圖1 苦蕎FtERDs家族基因序列的聚類圖Fig.1 Dendrogram of sequences of FtERD gene family in Tartary buckwheat
基于出苗后5、10、15 d苦蕎莖的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,共檢測(cè)出22個(gè)FtERDs基因在苦蕎幼苗莖中表達(dá),包含17個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),但其表達(dá)模式不盡一致(圖2).其中,5個(gè)DEGs的表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì),6個(gè)DEGs的表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢(shì),3個(gè)DEGs的表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì),3個(gè)DEGs的表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì).對(duì)具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的FtERDs蛋白的基因表達(dá)量進(jìn)行分析,F(xiàn)tPinG00207.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01均在苗期15 d高表達(dá),F(xiàn)tPinG50564.01在苗期10和15 d高表達(dá),而FtPinG85532.01在5 d高表達(dá),而在15 d低表達(dá),F(xiàn)tPinG17078.01和FtPinG50576.01則在3個(gè)時(shí)期均未檢測(cè)到表達(dá)量.
圖2 幼苗期苦蕎FtERDs的表達(dá)熱圖Fig.2 Heatmap of expression levels of FtERDs in Tartary buckwheat in the seedling stage
對(duì)22個(gè)苦蕎FtERDs基因的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析(圖3),結(jié)果表明:FtPinG85532.01與FtPinG34458.01、FtPinG69530.01呈顯著正相關(guān),與FtPinG46441.01、FtPinG53917.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01、FtPinG69533.01、FtPinG27172.01呈顯著負(fù)相關(guān);FtPinG34458.01與FtPinG69530.01呈顯著正相關(guān),與FtPinG46441.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01呈顯著負(fù)相關(guān);FtPinG69530.01與FtPinG46441.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01呈顯著負(fù)相關(guān);FtPinG23719.01與FtPinG66513.01、FtPinG27178.01呈顯著正相關(guān);FtPinG66513.01與FtPinG50691.01呈顯著正相關(guān),與FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01呈顯著負(fù)相關(guān);FtPinG46441.01與FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG71941.01與FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG50588.01與FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG61778.01與FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG53917.01與FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG63108.01與FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG78049.01與FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān);FtPinG00207.01與FtPinG78053.01、FtPinG50564.01、FtPinG69533.01呈顯著正相關(guān);FtPinG50564.01與FtPinG50691.01呈顯著正相關(guān);FtPinG69533.01與FtPinG27172.01、FtPinG50691.01、FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān);FtPinG27172.01與FtPinG50691.01、FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān);FtPinG50691.01與FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān);FtPinG27178.01與FtPinG27178.01呈顯著正相關(guān).
圖3 苦蕎FtERDs基因表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of FtERDs expression in Tartary buckwheat
苦蕎苗期利用15% PEG進(jìn)行模擬干旱處理,選擇8個(gè)苦蕎FtERDs基因進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明,PEG處理8 h,5個(gè)FtERDs基因的表達(dá)量均上調(diào),倍數(shù)3.10~11.31,這些基因可能在早期干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用.另外2個(gè)FtERDs與對(duì)照差異不顯著,1個(gè)FtERD下調(diào)表達(dá)(圖4).其中FtPinG34458.01、FtPinG85532.01、FtPinG00207.01、FtPinG50588.01表達(dá)量顯著或極顯著高于對(duì)照,F(xiàn)tPinG17078.01表達(dá)量顯著低于對(duì)照.
*和**分別表示差異達(dá)到顯著或極顯著水平.圖4 PEG脅迫下苦蕎FtERDs基因表達(dá)的分析Fig.4 Analysis of FtERDs expression in Tartary buckwheat under PEG treatment
ERD受逆境脅迫快速誘導(dǎo),參與調(diào)節(jié)逆境脅迫應(yīng)答與耐受性[1-4].ERD6是家族中被鑒定的首個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過(guò)介導(dǎo)糖的跨膜運(yùn)輸調(diào)控植物的逆境耐受能力[1].基于苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),在49個(gè)FtERDs基因中鑒定出28個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因.通過(guò)氨基酸序列分析表明,19個(gè)苦蕎FtERDs的ORF編碼蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域,其中,3個(gè)FtERDs蛋白具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,5個(gè)FtERDs蛋白具有12個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)域,推測(cè)這些FtERDs編碼蛋白均能參與跨膜運(yùn)輸.
ERD家族包括糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、泛素、熱激蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、ATP依賴型蛋白酶調(diào)節(jié)亞基等多種蛋白[1-5].利用擬南芥AtERDs與苦蕎糖轉(zhuǎn)運(yùn)AtERDs序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,結(jié)果表明,苦蕎28個(gè)FtERDs與15個(gè)擬南芥AtERDs基因可歸為4大類,不同類型中ERDs的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這可能與ERD家族基因來(lái)源的廣泛性有關(guān)[2].
苦蕎幼苗發(fā)育過(guò)程中共檢測(cè)22個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因的表達(dá),其表達(dá)模式不盡相同,這些基因可能在幼苗不同發(fā)育時(shí)期發(fā)揮功能.例如,F(xiàn)tPinG85532.01、FtPinG34458.01、FtPinG69530.01在出苗后5 d高表達(dá),隨后逐漸下降,這些基因可能主要在種子出苗前期發(fā)揮功能;9個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因,包括編碼多跨膜結(jié)構(gòu)功能域的FtPinG00207.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01基因在苗期15 d高表達(dá),3個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因,包括FtPinG50564.01在苗期10和15 d高表達(dá),這些基因可能在苗期的中后期發(fā)揮功能.另外,5個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)FtERDs基因在3個(gè)時(shí)期穩(wěn)定表達(dá),這些基因可能在幼苗發(fā)育過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮作用.相關(guān)性分析表明,苦蕎FtERDs基因間存在許多顯著正相關(guān)與負(fù)相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明這些FtERDs基因間可能存在協(xié)同效應(yīng)或功能互補(bǔ)效應(yīng).
Kiyosue et al[2]首次利用干旱脅迫鑒定出26個(gè)AtERDs基因,證實(shí)AtERDs在早期響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用.苦蕎起源于中國(guó)的西南部,主要種植于高寒山區(qū),具有較強(qiáng)的耐旱能力.本試驗(yàn)利用PEG模擬干旱脅迫,在8 h后發(fā)現(xiàn)5個(gè)FtERDs基因表達(dá)量上調(diào)明顯,推測(cè)這些基因可能在響應(yīng)早期干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用.其中,干旱脅迫下FtPinG34458.01、FtPinG85532.01表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組,達(dá)到10倍以上,猜測(cè)它們可能是苦蕎早期響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵基因.研究結(jié)果可為下一步深入探索FtERDs基因參與調(diào)控苦蕎干旱逆境響應(yīng)與抗旱機(jī)制提供依據(jù).