程安怡, 趙金鵬, 黃小紅, 張偉妮,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)俗稱黃花魚(yú)，屬鱸形目石首魚(yú)科黃魚(yú)屬，是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水魚(yú)種.據(jù)《2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，2020年我國(guó)大黃魚(yú)產(chǎn)量為25.4萬(wàn)t.大黃魚(yú)因其體色金黃、寓意吉祥、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受我國(guó)等東南亞各國(guó)人民的喜愛(ài).然而，隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病問(wèn)題日益突出，已成為制約大黃魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[1].其中，細(xì)菌性疾病造成的死亡率占養(yǎng)殖大黃魚(yú)總死亡率的40%[2].革蘭氏陰性菌是導(dǎo)致大黃魚(yú)細(xì)菌病的主要致病菌，如引起內(nèi)臟白點(diǎn)病的假單胞菌[3]、引起體表潰瘍癥的弧菌[4-5]、引起細(xì)菌性腸炎病的氣單胞菌[6]等.

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分之一，是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，也稱內(nèi)毒素.作為革蘭氏陰性菌的主要致病成分之一，LPS可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，作為免疫激活劑廣泛用于免疫學(xué)相關(guān)研究[7].

頭腎是魚(yú)類(lèi)的主要免疫器官之一，是巨噬細(xì)胞增殖和分化的主要場(chǎng)所.頭腎巨噬細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與了對(duì)外來(lái)病原微生物的識(shí)別與吞噬、抗原的處理和遞呈、特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)等，其細(xì)胞活性是魚(yú)體免疫功能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[8].研究表明，LPS具有強(qiáng)免疫原性，能促進(jìn)魚(yú)類(lèi)巨噬細(xì)胞的活化[9-10].然而，LPS對(duì)魚(yú)類(lèi)巨噬細(xì)胞的激活作用機(jī)制尚不明確.本研究以大黃魚(yú)原代頭腎巨噬細(xì)胞(primary head kidney macrophages, PKM)為研究對(duì)象，檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞吞噬活性、氮呼吸爆發(fā)、促炎因子轉(zhuǎn)錄水平及受體[Toll樣受體(TLR)、甘露糖受體(MR)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體]基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，明確LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM的激活作用，有利于進(jìn)一步研究LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM的調(diào)控機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚(yú) 試驗(yàn)所用大黃魚(yú)購(gòu)于福建寧德富發(fā)大黃魚(yú)養(yǎng)殖基地，體長(zhǎng)(23±5) cm，體重(376±35) g.

1.1.2 主要試劑 LPS購(gòu)于Sigma公司；Percoll購(gòu)于GE Healthcare公司；GIBCO Leibovitz′s無(wú)酚紅L-15培養(yǎng)基、GIBCO胰酶(0.25% EDTA)、PE-熒光微球購(gòu)于Thermo公司；DAF-FM DA(NO熒光探針)購(gòu)于碧云天公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于天根公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Go Taq?qPCR Master Mix 購(gòu)于Promega公司.

1.2 方法

1.2.1 大黃魚(yú)PKM的分離和培養(yǎng) 大黃魚(yú)PKM的分離和培養(yǎng)參考本課題組之前的方法[11].將健康的大黃魚(yú)用丁香酚麻醉后剖取頭腎，過(guò)70 μm細(xì)胞篩研磨，細(xì)胞懸液經(jīng)34%/51% Percoll密度梯度離心、貼壁處理，得到大黃魚(yú)PKM，用無(wú)酚紅的L-15培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)備用.

1.2.2 吞噬活性的檢測(cè) PKM吞噬活性的檢測(cè)參考本課題組之前的方法[11].細(xì)胞分別用含0、0.01、0.1、1、10和100 μg·mL-1LPS的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每個(gè)含量設(shè)置3個(gè)重復(fù).棄去培養(yǎng)基，加入1 μL PE-熒光微球，于28 ℃避光孵育3 h后收集細(xì)胞，用AccuriTMC6 Plus流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.3 氮呼吸爆發(fā)的檢測(cè) PKM氮呼吸爆發(fā)的檢測(cè)參考本課題組之前的方法[11].細(xì)胞分別用含0、0.01、0.1、1、10和100 μg·mL-1LPS的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每個(gè)含量設(shè)置3個(gè)重復(fù).棄去培養(yǎng)基，加入10 μmol·L-1DAF-FM DA，于28 ℃孵育20 min后收集細(xì)胞，用AccuriTMC6 Plus流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.2.4 免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) PKM經(jīng)10 μg·mL-1LPS分別處理3、6、12和24 h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行.按照Promega細(xì)胞總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明，在不同處理時(shí)間收集細(xì)胞提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA第1鏈，用Go Taq?qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)LPS對(duì)3種促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)和7種受體基因(TLR1、TLR2、TLR21、MR1、MR2、NOD1、NOD2)mRNA表達(dá)量的影響.所用特異性引物如表1所示.以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到各組樣品的Ct值作均一化處理，通過(guò)2-△△Ct計(jì)算各組樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用LSD判定組間的差異性，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著.流式細(xì)胞儀所測(cè)數(shù)據(jù)用FlowJo軟件進(jìn)行處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM吞噬活性的影響

PKM具有吞噬熒光微球的能力.圖1a顯示，從左往右，第2個(gè)峰表示細(xì)胞吞噬一個(gè)微球，越往右表示其吞噬微球數(shù)量越多.用LPS(0.1、1、10、100 μg·mL-1)處理24 h后，與空白對(duì)照組相比，峰值明顯升高且右移，說(shuō)明細(xì)胞吞噬熒光微球的數(shù)量增多.對(duì)各組的平均熒光值進(jìn)行差異性分析，結(jié)果(圖1b)顯示，1、10、100 μg·mL-1LPS處理24 h可以極顯著地增強(qiáng)大黃魚(yú)PKM的吞噬能力(P<0.01)，0.1 μg·mL-1LPS處理24 h可以顯著增強(qiáng)PKM的吞噬能力(P<0.05)，0.01 μg·mL-1LPS處理24 h的吞噬能力與空白對(duì)照組的差異不顯著.

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖1 不同含量LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM吞噬活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LPS on phagocytic activity of PKM from L.crocea

2.2 LPS對(duì)PKM氮呼吸爆發(fā)的影響

圖2a顯示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)1、10、100 μg·mL-1LPS處理24 h后，熒光峰明顯右移，說(shuō)明細(xì)胞NO生成量增加.通過(guò)對(duì)各組的平均熒光值進(jìn)行差異性分析，結(jié)果(圖2b)顯示：與空白對(duì)照組相比，1、10、100 μg·mL-1LPS處理組的平均熒光值極顯著升高(P<0.01)；而0.01、0.1 μg·mL-1LPS處理組的平均熒光值與空白對(duì)照組的差異不顯著.

**表示P<0.01.圖2 不同含量LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM氮呼吸爆發(fā)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of LPS on nitrogen respiration burst of PKM from L.crocea

2.3 LPS對(duì)PKM 3種促炎因子mRNA表達(dá)水平的影響

LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM 3種促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA表達(dá)水平的影響(圖3)顯示，用10 μg·mL-1LPS處理大黃魚(yú)PKM后，IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)水平在3、6、12和24 h均極顯著上調(diào)(P<0.01).

**表示P<0.01.圖3 LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM 3種促炎因子mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of LPS on mRNA expression of 3 pro-inflammatory cytokines in PKM from L.crocea

2.4 LPS對(duì)PKM 3種Toll樣受體mRNA表達(dá)水平的影響

LPS對(duì)PKM 3種Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR21)mRNA表達(dá)水平的影響(圖4)顯示：用10 μg·mL-1LPS處理后，大黃魚(yú)PKMTLR1 mRNA的表達(dá)水平在24 h極顯著上調(diào)(P<0.01)，在12 h顯著上調(diào)(P<0.05)，在6 h無(wú)顯著變化；TLR2 mRNA的表達(dá)水平在6、12和24 h極顯著上調(diào)(P<0.01)；TLR21的表達(dá)水平在3 h無(wú)顯著變化，在6、12和24 h極顯著上調(diào)(P<0.01).

*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖4 LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM 3種Toll樣受體 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of LPS on mRNA expression of 3 Toll-like receptors in PKM from L.crocea

2.5 LPS對(duì)PKM 2種甘露糖受體mRNA表達(dá)水平的影響

圖5顯示：用10 μg·mL-1LPS處理后，PKM甘露糖受體MR1 mRNA的表達(dá)水平在3、6、12和24 h均極顯著下調(diào)(P<0.01)；甘露糖受體MR2 mRNA的表達(dá)水平在3、6、12和24 h均極顯著上調(diào)(P<0.01).

**表示P<0.01.圖5 LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM 2種甘露糖受體mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of LPS on mRNA expression of 2 mannose receptors in PKM from L.crocea

2.6 LPS對(duì)PKM 2種NOD樣受體mRNA表達(dá)水平的影響

圖6顯示，用10 μg·mL-1LPS處理大黃魚(yú)PKM后，2種NOD樣受體NOD1和NOD2 mRNA的表達(dá)水平在3、6、12和24 h均極顯著上調(diào)(P<0.01).

**表示P<0.01.圖6 LPS對(duì)大黃魚(yú)PKM 2種NOD樣受體mRNA表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of LPS on mRNA expression of 2 NOD receptors in PKM from L.crocea

3 討論

巨噬細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能.通常情況下，魚(yú)體中的巨噬細(xì)胞處于相對(duì)靜止的狀態(tài)，吞噬活性和需氧代謝都很低，僅具有一定的非特異性吞噬和趨化能力.當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，通過(guò)經(jīng)典或替代途徑分化成M1或M2型巨噬細(xì)胞[12].M1型巨噬細(xì)胞的典型標(biāo)志是吞噬能力增強(qiáng)、大量合成促炎因子、產(chǎn)生NO和O2-等反應(yīng)氧族，主要參與病原的清除和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)[13]；相反，M2型巨噬細(xì)胞能分泌抗炎因子和精氨酸酶等，減少NO生成，修復(fù)細(xì)胞因炎癥反應(yīng)帶來(lái)的損傷，利于組織修復(fù)[14].本研究結(jié)果顯示，LPS能夠增強(qiáng)大黃魚(yú)PKM的吞噬能力，提高NO的生成量，上調(diào)3種促炎因子基因(IL-1β、IL-6、IL-8)的表達(dá)水平，說(shuō)明LPS可以激活大黃魚(yú)PKM，并刺激其向M1型巨噬細(xì)胞分化.這與在人原代外周血巨噬細(xì)胞[15]、小鼠原代腹腔和腸道巨噬細(xì)胞[16]、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7[17]及雞巨噬細(xì)胞HD11[18]中的結(jié)果是一致的.IL-1β、IL-6和IL-8是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的3種主要促炎因子.在炎癥反應(yīng)中，IL-1β可以活化T細(xì)胞并促進(jìn)其增殖分化，IL-6可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化、產(chǎn)生抗體，而IL-8主要起到趨化中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的作用[19].本研究中隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-8 mRNA表達(dá)量的升高最明顯，說(shuō)明其趨化作用逐漸增強(qiáng)，促使炎癥反應(yīng)加劇.

Toll樣受體是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能識(shí)別多種病原體相關(guān)分子模式.位于革蘭氏陰性菌外膜上的LPS，能夠與宿主細(xì)胞表面Toll樣受體結(jié)合從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[20].在哺乳動(dòng)物中，已證實(shí)TLR4是LPS的主要識(shí)別受體[21]，LPS可被TLR4識(shí)別誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞的活化，產(chǎn)生 IL-1β、IL-6、TNF-α和NO[22].然而在魚(yú)類(lèi)中，僅有少數(shù)鯉科魚(yú)類(lèi)存在TLR4，且已證實(shí)其對(duì)LPS刺激不響應(yīng)[23].

TLR1和TLR2都屬于TLR1亞家族，分布在細(xì)胞膜上，主要識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和病毒；TLR21屬于TLR11亞家族，也分布在細(xì)胞膜上，能夠廣泛識(shí)別RNA和DNA病毒以及侵染的細(xì)菌，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[24].秦勤等[25]研究表明，LPS刺激48 h后可以提高人角膜上皮細(xì)胞中TLR1和TLR2基因的表達(dá)量；王梁華等[15]研究表明，TLR2抗體可以抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的激活，證明TLR2參與了細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別；馮偉科等[26]研究表明，LPS能誘導(dǎo)鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR2 mRNA表達(dá)量的上調(diào)；盛金良等[20]研究表明，在LPS刺激后，綿羊肺泡巨噬細(xì)胞TLR2 mRNA在12 h的表達(dá)水平最高.在本研究中，LPS刺激6 h后開(kāi)始能夠極顯著上調(diào)大黃魚(yú)PKMTLR2和TLR21 mRNA的表達(dá)量，刺激12 h后能夠顯著上調(diào)TLR1 mRNA的表達(dá)量.不同的TLR成員識(shí)別不同的特異性配體，目前尚無(wú)魚(yú)類(lèi)TLR與LPS識(shí)別的直接證據(jù).本研究結(jié)果顯示，大黃魚(yú)PKMTLR1、TLR2和TLR21對(duì)LPS刺激均有響應(yīng)，其中，TLR21響應(yīng)程度最強(qiáng)，然而其是否直接參與了細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別還需要進(jìn)一步證實(shí).

甘露糖受體是一種跨膜糖蛋白，屬于C型凝集素家族，在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上均存在[27-28].甘露糖受體是吞噬細(xì)胞重要的模式識(shí)別受體和內(nèi)吞受體，可以識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性的糖分子[29].已有研究表明，巨噬細(xì)胞能通過(guò)甘露糖受體的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)識(shí)別LPS，從而介導(dǎo)對(duì)病原菌的清除[30].本研究結(jié)果顯示：大黃魚(yú)PKMMR1和MR2對(duì)LPS刺激均有響應(yīng)，但變化趨勢(shì)不同；LPS能夠顯著上調(diào)MR2的表達(dá)，下調(diào)MR1的表達(dá)，揭示了2種甘露糖受體在LPS識(shí)別過(guò)程中行使著不同的功能.

NOD1和NOD2都是NOD樣受體家族的成員，在細(xì)菌識(shí)別和激活免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[31].NOD2主要在骨髓細(xì)胞、單細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)；NOD1的分布更廣泛，上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[32].在魚(yú)類(lèi)中，NOD1能響應(yīng)革蘭氏陰性菌的感染，并可能在細(xì)菌成分的鑒定中發(fā)揮重要作用.NOD1可以識(shí)別LPS，通過(guò)受體相互作用絲氨酸蘇氨酸激酶2(RIPK2)激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng).LPS可以通過(guò)與鮸魚(yú)(Miichthysmiiuy)巨噬細(xì)胞NOD1結(jié)合并激活NF-κB發(fā)揮調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)[33].本研究結(jié)果表明，大黃魚(yú)PKMNOD1和NOD2均對(duì)LPS的刺激有響應(yīng).

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，LPS可以顯著提高大黃魚(yú)PKM的吞噬活性和NO生成量，上調(diào)細(xì)胞IL-1β、IL-6和IL-8等3種促炎因子基因的表達(dá)，對(duì)大黃魚(yú)PKM有明顯的激活作用，并刺激其向M1型巨噬細(xì)胞分化.此外，TLR1、TLR2、TLR21、MR2、NOD1和NOD2對(duì)LPS刺激均有響應(yīng)，魚(yú)類(lèi)巨噬細(xì)胞識(shí)別LPS的關(guān)鍵受體還有待進(jìn)一步研究.