趙雨農(nóng)，李 盼，段夢琪，商 鵬，張 博

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽育種國家工程實驗室/高原畜禽遺傳資源研究中心，北京 100193；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

我國是豬肉生產(chǎn)與消費大國，目前豬肉市場大多被瘦肉型三元雜交豬占據(jù)[1-2]。此類豬種具有生長速度快、瘦肉率高的特點，但其肉品質(zhì)遠不如我國許多地方豬種，比如民豬、金華豬、藏豬等[3-5]。近年來，我國對畜禽種業(yè)越來越重視，對本土種質(zhì)資源的普查、保存、開發(fā)及利用已是當前遺傳育種的重要任務(wù)之一。藏豬是我國特有的小型高原豬種，具有生長速度慢、肉質(zhì)風(fēng)味佳的特點，深受廣大民眾喜愛[6-7]，但其出欄周期長、養(yǎng)殖成本高，通過分子育種技術(shù)對藏豬生長發(fā)育相關(guān)性狀開展研究是推動本地品種更好地進入市場、最終實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要手段。

PGM1（Phosphoglucomutase1）是一個有效的磷酸葡萄糖變位酶，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。豬PGM1基因位于6 號染色體長臂末端，與多個肌肉生長或肉品質(zhì)相關(guān)基因位于同一區(qū)域[8-11]。PGM1基因在豬組織中廣泛表達，其中骨骼肌中的表達最豐富[12]，該基因缺乏可能直接影響糖原代謝、糖酵解和蛋白質(zhì)糖基化。PGM1基因與肌肉形成過程有密切聯(lián)系，能夠影響肌肉發(fā)育[13]。

本研究選擇中國地方豬種藏豬和引進豬種約克夏豬為研究對象，采用Sanger 測序?qū)GM1基因5'端上游3 000 bp 的單核苷酸多態(tài)性位點進行篩選，通過熒光定量檢測藏豬和約克夏豬的肝臟、背最長肌、背脂組織中PGM1基因mRNA 水平表達量，分析PGM1基因?qū)Σ刎i生長發(fā)育的調(diào)控功能，為藏豬資源保護和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究選擇飼養(yǎng)在西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實習(xí)牧場的180 日齡大小體重相近、性別均為公豬、飼喂方式相同、健康狀況良好的藏豬（TP）和約克夏豬（YY）各6 頭，屠宰采集肝臟、背最長肌、背脂等組織，液氮速凍，-80℃保存，用于總RNA 提取。另外，采集80份耳組織（藏豬40 頭，約克夏豬40 頭），放入75%酒精中，-20℃保存，用于基因組DNA 提取。

1.2 DNA、RNA 提取與cDNA 合成 采用苯酚/ 氯仿抽提法從耳組織中提取基因組DNA[14]，用1% 瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計檢測DNA 質(zhì)量和濃度，RNase-Free ddH2O 溶解，-20℃保存。

利用RNA 提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，CW0584S）提取實驗豬背最長肌、背脂和肝臟組織的總RNA。用Nano Drop 2000 分光光度計檢測RNA 質(zhì)量和濃度，-80℃保存。

采用cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（北京天根生化科技有限公司，KR180123）進行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNPs 篩選與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

1.3.1 引物設(shè)計與合成 從NCBI 網(wǎng)站下載PGM1基因組序列（登錄號：NC_010448.4），使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計5'側(cè)翼區(qū)3 000 bp 序列的特異性引物（表1）。由北京六合華大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

1.3.2 SNPs 篩選 利用驗證成功的特異性引物對藏豬和約克夏豬分別進行特異性片段擴增，每個品種準備10 個個體，將擴增產(chǎn)物進行混池，并由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用Chromas Pro

2.1.3 軟件對測序結(jié)果進行分析，篩選SNPs 位點。利用PCR-RFLP 法擴大檢測個體數(shù)量，統(tǒng)計分析基因型和基因頻率。使用限制性內(nèi)切酶Kpnl（GGTAC^C）進行酶切，酶切體系總體積為20 μL：Kpnl 1 μL，PCR 產(chǎn)物3.5 μL，NEB buffer 2 μL，ddH2O 13.5 μL，37℃酶切過夜。藏豬和約克夏豬各做40 個個體酶切。

1.4 實時熒光定量PCR

1.4.1 實時熒光定量PCR 定量引物 本實驗以RNF7基因為內(nèi)參基因，RNF7和PGM1基因引物序列分別來自Wang 等[15]、于江宇等[16]（表2），由北京華大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

表2 豬RNF7、PGM1 基因RNA 引物序列

1.4.2 實時熒光定量PCR 以cDNA 為模板，每個個體設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，選擇SYBR Green Mix 定量PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)P171206）對PGM1基因進行實時熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt方法計算基因的mRNA 表達水平。

樣品目的基因的表達量采用2-ΔΔCt法計算：

ΔCt（樣品）=Ct（樣品目的基因）–Ct（樣品內(nèi)參基因）

ΔCt（標準樣）=Ct（標準樣目的基因）–Ct（標準樣內(nèi)參基因）

ΔΔCt=ΔCt（樣品)–ΔCt（標準樣）

目的基因表達量=2-ΔΔCt

1.5 統(tǒng)計分析 利用χ2檢驗分析基因型分布和基因型頻率差異。利用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，SigmaPlot 10.0 軟件作圖，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著，P>0.05 無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型頻率和等位基因頻率分布 通過Sanger 測序發(fā)現(xiàn)藏豬PGM1基因在5' 側(cè)翼區(qū)1 636 bp 處有1 個多態(tài)性位點，記為A-1636G（圖1）。利用PCR-RFLP法分別將藏豬和約克夏豬各40 個個體產(chǎn)物進行酶切，共計產(chǎn)生3 種基因型即AA、AG、GG（圖2）。當酶切的2 條片段長度分別為840 bp 和165 bp 時，該基因型記為AA 型；當酶切片段切成2 個片段，長度分別為1 005 bp 和840 bp 時，該基因型記為雜合型AG 型；當酶切片段切成一個片段，長度為1 005 bp，該基因型記為GG 型。

圖1 A-1636G 突變測序峰圖

圖2 PGM1 基因酶切檢測結(jié)果

根據(jù)酶切結(jié)果計算基因型頻率和基因頻率，結(jié)果見表3。由表3 可知，約克夏豬PGM1基因酶切位點優(yōu)勢基因型為AA；而藏豬的優(yōu)勢基因型為GG，約克夏豬的A 基因頻率明顯高于藏豬。經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，該酶切位點在藏豬及約克夏豬中均符合哈迪-溫伯格平衡定律，在2 個品種間呈極顯著差異。

表3 PGM1 基因PCR-RFLP 基因型頻率及卡方檢驗

2.2PGM1基因mRNA 表達PGM1基因在藏豬肝臟中表達量極顯著高于約克夏豬，在藏豬背最長肌中表達量顯著高于約克夏豬，在藏豬背脂中表達量極顯著低于約克夏豬（圖3）。

圖3 PGM1 基因在肝臟、背最長肌和背脂組織中的表達量

3 討 論

藏豬產(chǎn)業(yè)是我國西藏地區(qū)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，如何進一步開發(fā)利用藏豬這一重要種質(zhì)資源對西藏自治區(qū)的發(fā)展有積極作用。藏豬的生長周期及脂肪的過度沉積直接影響了藏豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。PGM1是肌糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，與肌肉生長發(fā)育、脂肪沉積有著密切聯(lián)系[17]。Shang 等[18]通過組學(xué)數(shù)據(jù)的篩選及分析鑒定了PGM1基因在表達量高時對豬骨骼肌的生長發(fā)育具有抑制作用。

本研究通過對PGM1基因進行SNPs 位點篩選分析發(fā)現(xiàn)，于5'側(cè)翼區(qū)存在A-1636G 這一突變位點，符合哈迪-溫伯格平衡定律，且引進瘦肉型豬種約克夏豬的生長速度快、瘦肉率高；藏豬生長速度慢，瘦肉率偏低。藏豬和約克夏豬品種間該位點基因型頻率分布存在極顯著差異，由此初步判斷該SNP 位點AA 型為不利于脂肪沉積、生長速度快的基因型，GG 型為有利于脂肪沉積、生長速度慢的基因型。進一步在mRNA 水平研究發(fā)現(xiàn)，在背最長肌組織中，約克夏豬mRNA 表達量顯著低于藏豬；然而在脂肪組織中，約克夏豬mRNA 表達量極顯著高于藏豬，結(jié)果表明PGM1基因是增加肌內(nèi)脂肪（IMF）含量的有效基因。李慶崗[19]在對姜曲海瘦肉型豬早期發(fā)育規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉中肌糖原的儲存數(shù)量隨著生長發(fā)育高峰期的到來而升高。當機體內(nèi)肌糖原過度消耗后，肝臟組織通過分解肝糖原補充血糖以維持機體穩(wěn)態(tài)，因此PGM1基因在肝臟和背最長肌組織中的表達趨勢一致符合機體發(fā)育機理，也由此推測PGM1基因在豬肝臟、背最長肌組織中的高表達可能是通過促進肌糖原的代謝而抑制了生長發(fā)育，這與藏豬較約克夏豬生長速度慢、體長較短的生理特性相符。Meng 等[20]和Kim 等[21]分別通過對牛和豬的脂肪沉積、屠宰性能測定等方面進行研究發(fā)現(xiàn)，PGM1基因與脂肪生成、豬肉肉質(zhì)品質(zhì)等均有一定相關(guān)性。糖原的過度積累會導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為脂肪進行儲能，因此，在背脂組織中，該基因的表達量表現(xiàn)為約克夏豬極顯著高于藏豬，即約克夏豬脂肪組織中該基因表達量較高，能夠進一步促進肌糖原的消耗，抑制脂肪沉積，這與約克夏豬為瘦肉型、藏豬為脂肪型豬種相符合。聯(lián)合SNPs 位點分析及RTqPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏豬和約克夏豬的差異性在兩個實驗中趨于一致，推測可能該突變位點與調(diào)控豬肌肉生長、脂肪沉積性狀密切相關(guān)，本研究對后續(xù)開展大群體藏豬選育工作提供了重要分子依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實驗通過對PGM1基因DNA 和mRNA 水平研究發(fā)現(xiàn)，該基因5'側(cè)翼區(qū)存在1 個多態(tài)性位點A-1636G，其多態(tài)性與mRNA 表達差異性相關(guān)，即此位點可能是影響豬肌肉生長發(fā)育和脂肪沉積的功能位點，推測PGM1基因參與調(diào)控豬的肌肉生長發(fā)育，起到負調(diào)控作用，該結(jié)論為進一步探究豬生長發(fā)育的具體調(diào)控機制提供重要依據(jù)。