于士昌 翟建賓 趙臣亮 趙宏達(dá) 趙 亮
(河北省中醫(yī)院心胸外科,河北 石家莊 050011)
失血性休克(hemorrhagic shock,HS)是臨床常見病癥,主要由主動(dòng)脈瘤破裂、消化道大出血、手術(shù)創(chuàng)傷、外傷等導(dǎo)致體內(nèi)血液大量丟失,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1-2]。HS可誘導(dǎo)患者體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子,引發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng),引發(fā)腸屏障功能受損、腸黏膜通透性增高,造成腸道細(xì)菌移位,最終因腸源性膿毒血癥引起多器官功能障礙,是導(dǎo)致患者病亡的主要原因[3-5]。核因子-κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素(RANKL/OPG)信號(hào)通路是調(diào)控骨代謝的主要信號(hào)通路,也可參與調(diào)控炎性反應(yīng),下調(diào)RANKL/OPG表達(dá)可降低炎癥因子水平,減少牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤,顯著抑制牙槽骨丟失[6]。另外研究發(fā)現(xiàn),RANKL/OPG在炎癥性腸病中高表達(dá),與促炎因子白細(xì)胞介素8(IL-8)表達(dá)呈正相關(guān)[7],提示RANKL/OPG有望成為改善HS引發(fā)的腸屏障功能障礙的作用靶點(diǎn)。參附注射液來源于參附湯,主要由人參、附子2味中藥組成,可溫陽,益氣,固脫,主治陽虛、厥脫諸證。現(xiàn)代藥理研究表明,參附注射液能改善微循環(huán)、血壓,在HS的臨床搶救中應(yīng)用廣泛,并可降低膿毒癥患者氧化應(yīng)激水平,改善腸屏障功能損傷癥狀[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建HS小鼠模型,觀察參附注射液對(duì)HS小鼠RANKL/OPG信號(hào)通路及腸屏障功能的影響,結(jié)果如下。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠72只,體質(zhì)量18~22 g,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯) 20190003。飼養(yǎng)在中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動(dòng)物房中,室內(nèi)保持清潔,通風(fēng)良好,噪聲低于80 db,晝夜交替光照,溫度約23 ℃,相對(duì)濕度約55%。
1.1.2 主要試劑 參附注射液[華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字Z51020664];林格液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號(hào)LM25-03060);OCT包埋劑(上海鑫樂生物科技有限公司,貨號(hào)14020108926);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)分別為G1120、BC0020、BC0170、R0010);小鼠腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào)ZN2607);二胺氧化酶(DAO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A088-2);小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、兔源Anti-β-Tubulin一抗、兔源Anti-RANKL一抗、兔源Anti-OPG一抗(美國Abcam公司,貨號(hào)分別為ab197742、ab100713、ab102536、ab6046、ab9957、ab73400)。
1.1.3 主要儀器 血壓測(cè)量儀(BP100型,上海玉研科學(xué)儀器有限公司),冰凍切片機(jī)(CM1950型,德國Leica公司),光學(xué)顯微鏡(Olympus CKX41型,德國Leica公司),電泳儀(JS-power600型,上海培清科技有限公司),酶標(biāo)儀(Elx800型,美國Bio-Rad公司),轉(zhuǎn)膜儀(Power-pac 3000型,美國Bio-Rad公司),凝膠成像分析儀(ImageMaster型,Applied Biosystems公司)。
1.2 方法
1.2.1 小鼠分組 將72只BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,即假手術(shù)組、模型組、林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組,每組各12只。
1.2.2 HS小鼠模型建立 除假手術(shù)組小鼠外,其余5組小鼠均參照文獻(xiàn)[10],以15 mg/kg的劑量注射5%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉,固定在操作臺(tái),分離小鼠雙側(cè)股動(dòng)脈并置管,其中一側(cè)股動(dòng)脈導(dǎo)管連接血壓測(cè)量儀,持續(xù)測(cè)量小鼠血壓,經(jīng)另一側(cè)股動(dòng)脈導(dǎo)管取血,至小鼠血壓降至30 mmHg(3.99 kPa),記錄小鼠取血量,維持血壓在(30±5)mmHg狀態(tài)90 min,即完成HS小鼠造模。假手術(shù)組小鼠只分離雙側(cè)股動(dòng)脈并置管,不取血。
1.2.2 給藥 HS小鼠造模完成后,各藥物處理組立刻經(jīng)取血側(cè)股動(dòng)脈導(dǎo)管補(bǔ)液,均在30 min內(nèi)完成補(bǔ)液。林格液組小鼠予取血量3倍的林格液補(bǔ)液[11];參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組將參附注射液溶于林格液,配制成2.5、5.0、10.0 mL/kg的藥液[11],分別予取血量3倍的上述藥液補(bǔ)液;假手術(shù)組、模型組小鼠不進(jìn)行補(bǔ)液處理。
1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法
1.3.1 小鼠小腸組織病理損傷檢測(cè) 補(bǔ)液完成后6 h,各組小鼠經(jīng)股動(dòng)脈導(dǎo)管取血3 mL,然后取下雙側(cè)導(dǎo)管,處死小鼠。血液經(jīng)離心后,將上層血清保存于-80 ℃?zhèn)溆?;開腹取出小腸組織,剪下約1.0 g,剪碎后置于勻漿管中,加入高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液1.5 mL,4 ℃勻漿后離心,取上清液,按照試劑盒說明書,用BCA法測(cè)得其中總蛋白濃度,在-80 ℃保存?zhèn)溆?;其他小腸組織置于0.9%氯化鈉注射液中漂洗后,置于4%多聚甲醛溶液中固定,24 h后以30%蔗糖溶液脫水,48 h后加入OCT包埋劑,放置在-25 ℃包埋,最后以冰凍切片機(jī)切片,將所得冰凍切片取出,于室溫放置30 min、4 ℃丙酮固定10 min、3%過氧化氫(H2O2)溶液孵育5 min、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次后,按照試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行HE染色,最終封片,光學(xué)顯微鏡下觀察著色情況并任選5個(gè)視野拍照。根據(jù)小腸黏膜組織病理形態(tài),進(jìn)行Chiu評(píng)分[12]:正常腸黏膜評(píng)0分;絨毛頂端黏膜下出現(xiàn)間隙評(píng)1分;黏膜下間隙擴(kuò)大,腸黏膜與黏膜下層分離評(píng)2分;黏膜與黏膜下層分離延伸到腸絨毛兩側(cè)評(píng)3分;絨毛變鈍,固有層及其血管暴露,炎性組織浸潤評(píng)4分;固有層消化崩解,出血或形成潰瘍?cè)u(píng)5分。
1.3.2 小鼠小腸組織MDA、SOD水平和血清DAO、I-FABP、IL-1β、IL-6水平檢測(cè) 取出1.3.1中保存于-80 ℃的血清和小腸組織蛋白樣品液,提前在冰水浴中凍融,各取出300 μL,小腸組織蛋白樣品液中MDA、SOD水平采用可見分光光度法測(cè)定:向各組樣品液中加入各步驟相關(guān)試劑,以可見分光光度計(jì)測(cè)定560 nm(SOD)、600 nm(MDA)下的吸光度,計(jì)算SOD、MDA含量,具體步驟參照各試劑盒說明書進(jìn)行。血清DAO水平采用紫外比色法測(cè)定:向各組樣品液中加入各步驟相關(guān)試劑,以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定340 nm波長下的吸光度,計(jì)算DAO含量,具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行;血清I-FABP、IL-1β、IL-6水平采用ELISA法測(cè)定:向包被過的酶標(biāo)板中加入稀釋液和樣品液,混勻后37 ℃溫育30 min,洗滌后加入酶標(biāo)試劑溫育30 min,再次洗滌后加入顯色劑,37 ℃避光顯色15 min,加終止液終止反應(yīng),測(cè)定450 nm波長下的吸光度,計(jì)算I-FABP、IL-1β、IL-6含量,具體步驟參照各自試劑盒說明書進(jìn)行。
1.3.3 小鼠小腸組織RANKL/OPG通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 1.3.2中剩余的小腸組織蛋白樣品液,加入上樣緩沖液并于100 ℃下變性,各取含20 μg蛋白的樣品液,加入配制好的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)凝膠上樣孔中,使用110 V恒定電壓電泳后濕轉(zhuǎn),以5%的脫脂牛奶室溫孵育硝酸纖維膜1.5 h,封閉其上轉(zhuǎn)移的蛋白,裁剪膜,分離目的蛋白條帶,加入兔源Anti-β-Tubulin一抗、兔源Anti-RANKL一抗、兔源Anti-OPG一抗溶液,4 ℃孵育過夜后以TBST溶液洗膜,室溫孵育羊抗兔二抗溶液,2 h后以TBST溶液洗膜,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色后以凝膠成像分析儀采集蛋白條帶圖像,通過Image -Pro plus軟件分析各條帶灰度值,得出各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。
2.1 各組小鼠小腸黏膜組織病理變化 假手術(shù)組小鼠小腸組織黏膜正常,無病理變化;模型組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、絨毛破壞、塌陷,組織水腫嚴(yán)重,且有大量炎癥細(xì)胞浸潤,病理損傷最嚴(yán)重;林格液組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死明顯,絨毛形態(tài)排列紊亂、破壞重、組織充血明顯,可見少量炎癥細(xì)胞浸潤,病理損傷次嚴(yán)重;參附注射液低劑量+林格液組小鼠小腸黏膜上皮絨毛膜變鈍、黏膜與黏膜下層分離,組織水腫減輕,病理損傷稍減輕;參附注射液中劑量+林格液組小鼠小腸黏膜下間隙擴(kuò)大,絨毛膜變短,組織稍水腫,病理損傷減輕;參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜出現(xiàn)間隙,組織稍水腫,病理損傷最輕。見圖1。
圖1 各組小鼠小腸黏膜組織病理變化(HE,×400)
2.2 各組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分比較 見表1。
表1 各組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分比較 分,
由表1可見,模型組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分高于假手術(shù)組(P<0.05);林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分均低于模型組(P<0.05); 參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分均低于林格液組(P<0.05);參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評(píng)分低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。
2.3 各組小鼠血清DAO、I-FABP水平比較 見表2。
由表2可見,模型組小鼠血清DAO、I-FABP水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于模型組(P<0.05);參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于林格液組(P<0.05);參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。
表2 各組小鼠血清DAO、I-FABP水平比較
2.4 各組小鼠小腸組織MDA、SOD水平比較 表3。
表3 各組小鼠小腸組織MDA、SOD水平比較
由表3可見,模型組小鼠小腸組織MDA水平高于假手術(shù)組(P<0.05),SOD水平低于假手術(shù)組(P<0.05);林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于模型組(P<0.05),SOD水平高于模型組(P<0.05);參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于林格液組(P<0.05),SOD水平高于林格液組(P<0.05);參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05),SOD水平高于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05);參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),SOD水平高于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。
2.5 各組小鼠血清IL-1β、IL-6水平比較 見表4。
表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-6水平比較
由表4可見,模型組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于模型組(P<0.05);參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于林格液組(P<0.05);參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。
2.6 各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見表5。
表5 各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較
由表5可見,模型組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05);參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于林格液組(P<0.05);參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05),參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)見圖2。
A:假手術(shù)組;B:模型組;C:林格液組;D:參附注射液低劑量+林格液組;E:參附注射液中劑量+林格液組;F:參附注射液高劑量+林格液組
HS發(fā)生時(shí),機(jī)體器官會(huì)因大量失血發(fā)生缺血缺氧損傷,隨后因進(jìn)行復(fù)蘇而使血液再灌注,造成組織器官進(jìn)一步損傷,腸道損傷是HS后的一種主要并發(fā)癥,可引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征,增加患者死亡率,因此保護(hù)腸屏障功能對(duì)改善HS患者預(yù)后至關(guān)重要。缺血再灌注引發(fā)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致腸屏障功能損傷的主要致病機(jī)制[13-14]。DAO和I-FABP是腸黏膜組織中的重要蛋白,腸黏膜受損時(shí),可大量進(jìn)入血液中,因而血清DAO、I-FABP水平可作為判斷腸屏障受損程度的標(biāo)志[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過取出小鼠30%的總血容量來建立HS模型,結(jié)果顯示,小鼠大量失血后,可導(dǎo)致小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、數(shù)量減少、間隙增大,絨毛破壞、塌陷,排列紊亂,組織充血、水腫,且有大量炎癥細(xì)胞浸潤,病理損傷嚴(yán)重,Chiu評(píng)分、血清DAO、I-FABP、IL-1β、IL-6水平及小腸組織MDA水平升高,SOD水平降低,表明大量失血可誘導(dǎo)促炎因子IL-1β、IL-6水平升高,引發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),造成嚴(yán)重的腸黏膜病理損傷,破壞腸屏障功能,提示HS模型建立成功。
HS屬中醫(yī)學(xué)厥脫陽虛諸證,患者表現(xiàn)出病勢(shì)危急、脈細(xì)欲絕、陽氣欲脫、心腎陽虛等癥狀,參附注射液源自明代《校注婦人良方》中的參附湯,具有溫陽、固脫、益氣功效,對(duì)陽虛厥脫諸證有較好療效,利用現(xiàn)代藥物提取技術(shù)制成注射液,較傳統(tǒng)湯藥起效更快,臨床中用于HS、急性心力衰竭及心源性猝死等疾病治療,可降低膿毒癥患者氧化應(yīng)激水平,修復(fù)其腸屏障功能[8-9,17],還能明顯抑制創(chuàng)傷性心臟驟停復(fù)蘇引發(fā)的炎性反應(yīng),減輕腎細(xì)胞凋亡,改善腎功能[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,林格液單獨(dú)應(yīng)用和參附注射液低、中、高劑量+林格液聯(lián)合應(yīng)用復(fù)蘇HS小鼠,均可減輕腸黏膜病理損傷,降低腸黏膜組織Chiu評(píng)分、血清DAO、I-FABP、IL-1β及IL-6水平、小腸組織MDA水平,升高SOD水平,且參附注射液+林格液聯(lián)合應(yīng)用較林格液單獨(dú)應(yīng)用作用更強(qiáng),并呈劑量依賴性,表明以林格液復(fù)蘇HS小鼠,可降低促炎因子表達(dá),抑制炎癥,減弱氧化應(yīng)激,保護(hù)腸屏障;在林格液應(yīng)用的基礎(chǔ)上聯(lián)合參附注射液復(fù)蘇HS小鼠,可進(jìn)一步減弱炎癥及氧化應(yīng)激損傷,提高腸屏障保護(hù)功能,并隨參附注射液劑量升高而作用增強(qiáng)。
RANKL/OPG是骨代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)信號(hào),參與介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)展,在各種炎性疾病中的調(diào)控作用受到越來越多的關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn),RANKL/OPG信號(hào)在炎性腸道疾病中處于激活狀態(tài),HS可上調(diào)該通路蛋白表達(dá),誘導(dǎo)炎癥因子IL-6大量合成釋放,引發(fā)炎癥發(fā)生并進(jìn)展,延緩骨折愈合[7,19-20],但參附注射液對(duì)HS小鼠RANKL/OPG通路影響目前還未知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HS小鼠小腸組織中RANKL及OPG蛋白表達(dá)水平明顯升高,林格液單獨(dú)應(yīng)用和參附注射液低、中、高劑量+林格液應(yīng)用處理HS小鼠,均可降低小腸組織RANKL及OPG蛋白表達(dá)水平,且參附注射液+林格液應(yīng)用較林格液單獨(dú)應(yīng)用作用更強(qiáng),并呈劑量依賴性,表明RANKL/OPG信號(hào)參與調(diào)控HS后腸屏障損傷過程,參附注射液可抑制RANKL/OPG信號(hào)通路激活,保護(hù)腸屏障功能。
綜上所述,參附注射液可下調(diào)HS小鼠小腸組織RANKL、OPG蛋白表達(dá),抑制炎性反應(yīng)發(fā)生,降低氧化應(yīng)激水平,減輕腸黏膜損傷,促使其屏障功能恢復(fù),阻滯RANKL/OPG信號(hào)傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制。本研究進(jìn)一步證實(shí)了參附注射液可減輕HS引發(fā)的腸屏障功能損傷,并對(duì)其藥理機(jī)制進(jìn)行了初步探討,后續(xù)還應(yīng)對(duì)激活并抑制RANKL/OPG信號(hào)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,以探索更確切的作用機(jī)制。