錢曉慶，黃煌，陳茂彬，周冉冉，李可心，張玉*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；3.工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是一種好氣性絲狀真菌，歸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科、曲霉屬。米曲霉是通過(guò)孢子繁殖，發(fā)芽后長(zhǎng)出菌絲，其菌絲在生長(zhǎng)初期呈白色，在生長(zhǎng)后期呈黃綠色，老化后逐漸變?yōu)楹稚玔1-2]。分生孢子梗生長(zhǎng)在足細(xì)胞上，分生孢子頭一般呈放射狀，少數(shù)為疏松柱形，頂囊呈球形或燒瓶形[3]。米曲霉菌落生長(zhǎng)速度快、質(zhì)地疏松，最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，產(chǎn)酶最適宜溫度為28～30 ℃；相對(duì)濕度保持在95%左右比較合適；生長(zhǎng)的最適pH是6.0左右，偏高或偏低，均不利于米曲霉的菌體中酶的分泌，同時(shí)也會(huì)影響酶的活力。

米曲霉作為一種絲狀真菌在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用[4]，是酒類釀造、醬類及醬油生產(chǎn)的核心菌株。米曲霉主要通過(guò)分泌蛋白酶[5-6]、淀粉酶[7]、糖化酶[8]、纖維素酶[9]等酶類對(duì)原料中的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，從而提高發(fā)酵制品的風(fēng)味。目前，工業(yè)用酶的50%由絲狀真菌生產(chǎn)[10]，尤其是食品酶和飼料酶[11]。米曲霉易培養(yǎng)，不分泌黃曲霉毒素，1989年美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)和美國(guó)飼料公司協(xié)會(huì)認(rèn)定米曲霉為安全微生物菌種(generally regarded as safe， GRAS)[12]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，利用米曲霉等絲狀真菌作為表達(dá)宿主生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等工業(yè)酶制劑的研究也愈發(fā)廣泛。

我國(guó)人口眾多，對(duì)發(fā)酵制品的需求量較大，因而成本和品質(zhì)成為較為關(guān)注的問(wèn)題，為獲得性狀優(yōu)良的米曲霉菌株，更好地應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品，菌種的選育和改良在現(xiàn)代發(fā)酵菌種技術(shù)中處于重要地位。目前我國(guó)傳統(tǒng)釀造行業(yè)中一般是通過(guò)測(cè)定最終酶活力來(lái)反映發(fā)酵性能，從而選育優(yōu)良的米曲霉菌株，人們對(duì)于米曲霉分泌的酶系以及相關(guān)基因的調(diào)控也有一定的研究，但系統(tǒng)性的深入研究并不多。本文通過(guò)綜述米曲霉功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及在發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為后續(xù)米曲霉的研究提供指導(dǎo)。

1 米曲霉功能基因組學(xué)的研究進(jìn)展

功能基因組學(xué)是利用基因組項(xiàng)目產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)來(lái)描述基因和蛋白質(zhì)的功能和相互作用[13]。米曲霉在釀造工業(yè)中的重要應(yīng)用以及高效的胞外蛋白分泌能力與其相關(guān)基因的調(diào)控是分不開(kāi)的，研究表明米曲霉基因組中有135個(gè)胞外蛋白酶基因。全基因組序列的破譯為米曲霉基因組改組技術(shù)提供了基礎(chǔ)。Machida等成功破譯了米曲霉RIB40的基因組，研究發(fā)現(xiàn)米曲霉基因大小為37.9 Mb，大約有3800萬(wàn)堿基對(duì)，8條染色體，長(zhǎng)度分別為3.3，3.4，4.1，4.4，4.8，5.0，6.2，6.4 Mb，約1.2萬(wàn)個(gè)基因[14]。表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)和DNA微矩陣技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了米曲霉功能基因組學(xué)的發(fā)展。目前，大約有10個(gè)米曲霉菌株已被測(cè)序并存入公共NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，這些菌株的基因組大小從35.42～41.16 Mb不等，在1.2萬(wàn)個(gè)左右基因中，只有約200個(gè)基因功能被鑒定。對(duì)米曲霉基因組基因進(jìn)行GO功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，在分子功能方面，水解酶活性、氧化還原酶活性和轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性處在前列；在細(xì)胞組分方面，細(xì)胞核、膜和細(xì)胞質(zhì)位于前三名；在生物過(guò)程方面，大量基因參與了糖類、蛋白質(zhì)、脂類代謝以及分泌蛋白加工轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程[15]。米曲霉基因組中雖然大多數(shù)量基因是未知的，但是從基因組注釋來(lái)看，米曲霉適合作為良好的宿主細(xì)胞用于工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)基因組所包含的信息來(lái)控制米曲霉發(fā)酵，從而提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量[16]。

米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為進(jìn)一步從基因水平深入研究和基因改良菌株提供了條件。Zhao等[17]通過(guò)比較米曲霉RIB40和米曲霉3.042基因組與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)差異，發(fā)現(xiàn)了2種米曲霉不同的分泌調(diào)控機(jī)制，在米曲霉3.042菌株中發(fā)現(xiàn)了更多的與細(xì)胞生長(zhǎng)和環(huán)境抗性相關(guān)的基因，該菌株具有更強(qiáng)的生命力；而米曲霉RIB40特有的Na+、K+、甘油代謝相關(guān)基因較多，該菌株耐鹽脅迫能力較強(qiáng)。在兩個(gè)菌株中觀察到許多編碼酶的基因，這些酶對(duì)不同的醇、酸和氨基酸的產(chǎn)生有重要影響，在基因水平上分析了兩種米曲霉用于發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生不同風(fēng)味的原因。He等[18]通過(guò)對(duì)米曲霉不同生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了不同類型基因在生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，利用RNA-seq分析了米曲霉的3個(gè)階段，每個(gè)樣本產(chǎn)生了2700多萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量讀段。分析結(jié)果顯示，從適應(yīng)期向?qū)?shù)期和穩(wěn)定期過(guò)渡時(shí)，差異基因表達(dá)較多，而從對(duì)數(shù)期向穩(wěn)定期過(guò)渡時(shí)，差異基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)米曲霉基因組基因進(jìn)行了GO功能聚類分析，對(duì)不同生長(zhǎng)階段的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)這些基因大多在單生物過(guò)程、代謝過(guò)程和催化活性方面得到了富集。從適應(yīng)期向?qū)?shù)期轉(zhuǎn)化時(shí)大多數(shù)基因表達(dá)增加，從對(duì)數(shù)期向靜止期的穩(wěn)定表達(dá)主要涉及碳水化合物和氨基酸的代謝，這對(duì)米曲霉在發(fā)酵領(lǐng)域的作用從基因?qū)用孢M(jìn)行了解釋。

分析米曲霉分泌的各種酶的表達(dá)基因，將米曲霉進(jìn)行遺傳改造使其成為更加優(yōu)良的菌種，已經(jīng)成為米曲霉研究工作的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的米曲霉菌種改造有化學(xué)誘變、物理誘變、原生質(zhì)體融合法等方法，通過(guò)采用常壓室溫等離子體誘變改良米曲霉菌株[19-20]，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)突變株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，酶活力均有所提高，氨基酸和還原糖的含量也顯著提高，大大提升了釀造制品的品質(zhì)。Cheevadhanarak等[21]應(yīng)用寡核苷酸探針技術(shù)，從基因文庫(kù)中獲得了米曲霉堿性蛋白酶基因，并對(duì)該基因的序列進(jìn)行了分析和測(cè)定，將該蛋白酶基因轉(zhuǎn)化到米曲霉中，轉(zhuǎn)化株分泌的蛋白酶量為初始菌株的6倍。

新興發(fā)展的選擇性標(biāo)記基因應(yīng)用技術(shù)、染色體大片段刪除技術(shù)和DNA芯片技術(shù)等為米曲霉存在的mRNA的不穩(wěn)定[22]、自身蛋白酶分解錯(cuò)誤折疊的外源蛋白等不足提供了改善方法[23]，利用基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改造，如關(guān)鍵酶基因的超表達(dá)、代謝通路的激活、競(jìng)爭(zhēng)通路的抑制，可顯著提高米曲霉的生產(chǎn)能力。

通過(guò)基因組測(cè)序得到的編碼蛋白大部分是功能未知的蛋白，功能基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，可以對(duì)米曲霉功能性蛋白進(jìn)行更深層次的研究，為獲得更多目的蛋白信息提供了研究思路和基礎(chǔ)。

2 米曲霉蛋白組學(xué)的研究進(jìn)展

米曲霉作為絲狀真菌，其分泌物由高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)組成，包括多種活性酶。蛋白組學(xué)是研究特定條件下蛋白質(zhì)整體水平的存在狀態(tài)及活動(dòng)規(guī)律，主要包括蛋白質(zhì)樣品的制備、分離以及最終的鑒定。目前，米曲霉蛋白質(zhì)組主要集中在相關(guān)功能性蛋白的表達(dá)情況上，雙向電泳技術(shù)(two-dimentional electrophoresis，2-DE)及基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組分的分析。

Hayakawa等[24]利用淀粉酶-綠色熒光融合蛋白(AmyB-EGFP)，熒光觀察發(fā)現(xiàn)米曲霉胞外蛋白酶系參與分泌途徑主要分布于菌絲頂端，通過(guò)頂端分泌的方式分泌至胞外[25]。且在米曲霉中，同源蛋白分泌量可超過(guò)10 g/L，而非真菌異源蛋白的表達(dá)量很低。Oda K等[26]運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)，利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜比較了米曲霉RIB40在固體和液體培養(yǎng)條件下胞外蛋白的分泌情況，共鑒定出包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素降解酶在內(nèi)的29種蛋白。劉曄等[27]以米曲霉ZJGS-LZ-12為研究對(duì)象，以米曲霉3.042為對(duì)照，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)及生物質(zhì)譜檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)米曲霉ZJGS-LZ-12與米曲霉3.042胞外分泌蛋白組存在顯著差異，差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共169個(gè)，主要是淀粉水解酶、纖維素酶、半纖維素酶及蛋白質(zhì)酶，其中，淀粉水解酶、半纖維素酶活性顯著增強(qiáng)，這些酶參與糖類和蛋白質(zhì)水解過(guò)程，有利于豆制品的發(fā)酵生產(chǎn)。

在定性地明確米曲霉的分泌蛋白后，研究人員在已有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)不同條件下米曲霉所產(chǎn)生的酶的酶學(xué)性質(zhì)和活性，毛丙永等[28]從米曲霉3.042中分離純化得到一種耐鹽蛋白酶，并鑒定為鈣蛋白酶RIM13，該蛋白酶在高鹽度環(huán)境下仍具有較高的酶活力，在醬油的發(fā)酵生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。Zhao等[29]采用2-DE技術(shù)比較米曲霉100-8(米曲霉3.042注入N+誘變而來(lái))和米曲霉3.042的蛋白組學(xué)差異，鑒定出522個(gè)胞內(nèi)蛋白，其中451個(gè)為差異蛋白點(diǎn)，在米曲霉100-8中，細(xì)胞內(nèi)肽酶、糖酵解酶、tRNA合成酶、乙醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、硫胺生物合成酶等含量較高，它們參與糖酵解、氨基酸合成代謝、次級(jí)代謝過(guò)程，這些蛋白與釀造醬油的風(fēng)味相關(guān)，有助于增強(qiáng)醬油的風(fēng)味。國(guó)內(nèi)釀造行業(yè)普遍使用的醬油菌種是米曲霉滬釀3.042，產(chǎn)生的蛋白酶以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主，黑婷婷等[30]采用離子注入法誘變經(jīng)選育得到的A100-8菌株，其纖維素酶、糖化酶、蛋白酶活力較原菌種均有提高，有利于后續(xù)食品發(fā)酵的運(yùn)用。

目前對(duì)米曲霉蛋白質(zhì)功能的研究較少，已知功能的蛋白，它們的功能大多數(shù)是利用同源基因功能類推的方法推測(cè)出來(lái)的，米曲霉分泌蛋白的編碼基因部分見(jiàn)表1，從米曲霉分泌的蛋白質(zhì)入手，有助于更深一步了解基因組并闡明基因的功能，從而更加清晰地了解米曲霉的特性。

表1 米曲霉部分胞內(nèi)胞外蛋白的編碼基因Table 1 Genes encoding of some intracellular and extracellular proteins in Aspergillus oryzae

3 米曲霉在發(fā)酵制品領(lǐng)域的應(yīng)用

米曲霉是一種高產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，分泌包括蛋白酶在內(nèi)的多種酶類。按照米曲霉所分泌酶的酶活不同，將其在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用分為兩類：一種是分泌高活性的糖化酶，另一種是分泌高活性的蛋白酶。

高活性糖化酶分解淀粉質(zhì)原料的能力強(qiáng)，把含淀粉和糖質(zhì)原料的物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生酒精，這種米曲霉一般用于酒類釀造[31-32]。趙中開(kāi)等[33]通過(guò)優(yōu)化純種米曲霉酒曲的制備工藝，使得米曲酶糖化酶活力顯著提高到1110.79 U/g，為米曲霉酒曲的規(guī)?；a(chǎn)提供了理論依據(jù)。葛祎楠等[34]以板栗作為釀酒原料，通過(guò)對(duì)4種米曲霉酒曲的感官評(píng)價(jià)及酶活進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)米曲霉2011作為板栗清酒的糖化曲種，其α-淀粉酶活力為1306.63 U/g，糖化酶活力為324.56 U/g，酸性蛋白酶活力為1036.33 U/g，顯著改善了清酒的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

高活性的蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)，在醬類[35-37]及醬油[38-39]釀造中運(yùn)用較多。黃艷等以米曲霉A019為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變選育得到突變株ZA131，該突變株生長(zhǎng)較快，菌絲較長(zhǎng)而孢子較少，產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，尤其是蛋白酶提升了38.46%，谷氨酰胺酶提升了18.25%，谷氨酸生成率提升了11.18%，對(duì)醬油釀造風(fēng)味的提升有顯著貢獻(xiàn)；丁昊等[40]從米曲霉HDF-7中分離純化獲得的蛋白酶對(duì)大豆蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)氨基酸含量提高了18.2%，將純化的蛋白酶加入原料中代替制曲，大大縮短了制醬時(shí)間。

米曲霉廣泛用于酒類、醬類及醬油的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅直接關(guān)系到原料利用率的高低，還進(jìn)一步影響到發(fā)酵速度的快慢、成品的品質(zhì)及風(fēng)味等。因此，通過(guò)對(duì)米曲霉的功能基因組和蛋白組綜合比較分析研究，對(duì)米曲霉基因組-蛋白質(zhì)組信息及功能有了更加清晰的認(rèn)識(shí)，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的滋味、風(fēng)味、色澤的調(diào)控具有重要理論價(jià)值。

4 結(jié)論

米曲霉是我國(guó)傳統(tǒng)食品釀造行業(yè)中的核心菌株，是豆豉、醬油、清酒、黃酒等食品的關(guān)鍵發(fā)酵菌種，米曲霉主要通過(guò)分泌蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等酶類對(duì)原料中的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，提高發(fā)酵制品的品質(zhì)。米曲霉全基因組序列已經(jīng)被破譯，但仍有大多數(shù)基因功能尚不明確，因而運(yùn)用基因組學(xué)遺傳改造技術(shù)來(lái)改良米曲霉菌株存在諸多限制和障礙。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的承擔(dān)者，其種類和表達(dá)量都是特定情況下基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，因此將功能基因組-蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合起來(lái)分析，能夠更加準(zhǔn)確地闡述米曲霉機(jī)體的內(nèi)部調(diào)控和反應(yīng)機(jī)理，將有助于我們更加深入理解米曲霉酶系表達(dá)和酶蛋白分泌的調(diào)控機(jī)制，為有針對(duì)性地選育高蛋白酶活和高糖化酶米曲霉菌株提供了理論基礎(chǔ)，從而有效地提升發(fā)酵制品的質(zhì)量并降低生產(chǎn)過(guò)程中的成本，為米曲霉在食品行業(yè)的深度開(kāi)發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考。