況嘉鈾，屈廷啟，韋勝，王偉平*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué) 工程技術(shù)學(xué)院，武漢 430068)

紅曲色素是紅曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的天然、可食用的色素，具有著色力強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[1]，但是紅曲霉發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生真菌毒素——桔霉素[2]，嚴重影響食品安全，因此如何降低紅曲產(chǎn)品中桔霉素的含量已經(jīng)成為紅曲色素研究領(lǐng)域的重點問題。目前，為了控制紅曲霉發(fā)酵過程中桔霉素的合成量，同時保證紅曲色素的產(chǎn)率，國內(nèi)外學(xué)者分別從菌種的選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化[3-4]、基因分子水平調(diào)控[5]等方面進行研究，取得了較大進展。周珂等[6]通過液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化使紅曲黃色素達到了108.38 U/mL，Kumiar等[7]通過優(yōu)化培養(yǎng)基將紅曲色素的總產(chǎn)量提高了1.5倍；蔣冬花等[8]在基因分子水平上將紅曲霉色素相關(guān)基因(PigE)取代潮霉素抗性基因(hph)，得到1株高產(chǎn)紅曲黃色素產(chǎn)量為9232.86 U/g的基因工程M-piy菌株，比野生菌株提高了9.6倍，而桔霉素的含量顯著降低。

溫度是影響紅曲霉生長代謝的一個重要因素[9-11]。Tao等發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵溫度從30 ℃增加到35 ℃時，有利于強熒光紅曲黃色素的生成。管宏偉等[12]發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵溫度從26 ℃增加到30 ℃時黃色素的生成量提高了1倍，不同溫度下紅曲黃色素的生成存在明顯差異。本文研究了不同溫度對紅曲霉合成紅曲黃色素及桔霉素的影響，分析比較了發(fā)酵液的終止pH值，研究結(jié)果為紅曲色素發(fā)酵過程中的溫度控制提供了理論依據(jù)，對于食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)過程控制具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅曲霉(Monascus)GN：由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程實驗室保藏。

大米粉、黃豆粉：均為食用級；葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、瓊脂、KH2PO4、MgSO4·7H2O等：均為國藥分析純；乙腈：色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GI65DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司；ZGJH-1214垂直流超凈工作臺、ZHWY-2112B雙層特大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司； Thermo Fisher ST16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；722S可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、瓊脂3%，115 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：大米粉2%、黃豆粉1%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%，接種搖瓶培養(yǎng)，裝液量為200 mL/500 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉5%、黃豆粉1%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO4·7H2O 0.0005%、MnSO4·H2O 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%，100 mL/250 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：挑取1環(huán)紅曲霉GN于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d。

液體種子培養(yǎng)：用接種環(huán)在長好的斜面培養(yǎng)基中刮取2環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 d。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按體積分數(shù)10%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在不同溫度(20，22.5，25，27.5，30 ℃)下，以200 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d。

1.4.2 pH值的測定

采用pH計測定。

1.4.3 紅曲黃色素色價的測定

移取1 mL發(fā)酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60 ℃恒溫搖床中，200 r/min萃取1 h，4000 r/min離心15 min，取上清液稀釋至20倍，在410 nm處測定黃色素的吸光度。計算結(jié)果為OD值乘以稀釋倍數(shù)[13]。

紅曲黃色素的色價E(U/mL)=吸光度×200。

1.4.4 桔霉素的測定

HPLC色譜法：取發(fā)酵液5 mL，加入10 mL的無水乙醇，在60 ℃恒溫搖床中，200 r/min萃取1 h，在8000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，即得待測液。

HPLC色譜條件[14]：流動相：V(超純水，用磷酸調(diào)pH至 2.5)∶V(乙腈)為50∶50；熒光檢測：λex=331 nm，λem=500 nm；色譜柱：Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；體積流量：1 mL/min；柱溫28 ℃；上樣量：標準品及樣品均為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對發(fā)酵液終止pH值的影響

圖1 不同發(fā)酵溫度對紅曲霉終止pH值的影響Fig.1 Effect of different fermentation temperatures on the pH values of Monascus at the end of fermentation

在不同發(fā)酵溫度下，紅曲霉發(fā)酵液的終止pH值存在明顯差異。由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的降低，發(fā)酵終止pH值逐漸降低。在20 ℃時最低，pH值為2.89；30 ℃時最高，pH值為4.38。溫度對發(fā)酵過程中的影響主要表現(xiàn)為影響微生物生長過程中的酶反應(yīng)速率和生物合成途徑。微生物在不同溫度的發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的有機酸存在明顯區(qū)別[15]，如酵母菌在20 ℃時代謝產(chǎn)乙酸的能力強于25 ℃和30 ℃[16]；乳酸菌在不同溫度下隨著時間的變化，總酸呈現(xiàn)出不同的差異性[17]。紅曲霉在不同溫度下發(fā)酵終止pH值存在差異，這可能是因為溫度的改變影響了紅曲霉生長過程中淀粉酶、糖化酶等多種酶的酶活性和有機酸等酸性物質(zhì)的合成，導(dǎo)致隨著發(fā)酵溫度的降低，終止pH值逐漸降低。

2.2 溫度對紅曲色素合成的影響

不同發(fā)酵溫度下紅曲黃色素色價的測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵溫度對紅曲黃色素合成的影響 Fig.2 Effect of different fermentation temperatures on the synthesis of Monascus yellow pigment

由圖2可知，黃色素隨著溫度的升高先是呈現(xiàn)上升的趨勢，在22.5 ℃時達到最大值(黃色素色價為117.8 U/mL)，然后逐漸下降，在30 ℃時色素產(chǎn)量最低(黃色素色價為45.6 U/mL)。紅曲霉發(fā)酵合成的紅曲色素與H+的濃度密切相關(guān)[18]，Li等[19]發(fā)現(xiàn)pH值為3時的酸性發(fā)酵條件下，可以積累大量高純度(79.1%)的紅曲橙色素，所得橙色素的色價為76 U/mL。楊建等[20]研究發(fā)現(xiàn)當紅曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中補水(pH 4)時，總色價和橙色價可以達到最大值，分別為6600 U/g和2640 U/g；周波等[21]發(fā)現(xiàn)硝酸銨為氮源時會促進胞外黃色素的分泌，但對黃色素總生成量并沒有促進合成的效果，其黃色素色價最高為44.4 U/mL。低溫條件改變了發(fā)酵液中有機酸的組成，導(dǎo)致紅曲色素的合成與分泌發(fā)生了改變。過低的pH值會影響紅曲色素的生物合成[22]。20 ℃時終止pH值較低(pH<3)，抑制了紅曲黃色素的合成代謝，而22.5，25，27.5 ℃時表現(xiàn)為較高紅曲色素的生物合成。

2.3 溫度對桔霉素合成的影響

不同溫度對桔霉素合成的影響見圖3。

由圖3可知，桔霉素生成量隨著溫度的升高而呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢，與紅曲黃色素的合成趨勢相近。20 ℃時的桔霉素合成量為1.89 mg/L，隨著溫度的升高，當發(fā)酵溫度為22.5 ℃時達到最大值，桔霉素的生成量為4.38 mg/L，而后又隨著溫度的升高而逐漸降低，當發(fā)酵溫度為30 ℃時，桔霉素的合成量為1.71 mg/L，此時的桔霉素合成量最少。在20，25，27.5，30 ℃條件下，桔霉素的生物合成量較為接近，處于1.7～1.9 mg/L范圍內(nèi)。在2.1中得到20 ℃時終止pH值低于3，此時的桔霉素生物合成受到了抑制，隨著溫度的升高，發(fā)酵終止pH值大于3，抑制桔霉素合成的能力減弱。結(jié)果表明桔霉素的合成可能與發(fā)酵過程中的pH值具有一定的相關(guān)性，穆洪霞[23]發(fā)現(xiàn)當pH為2左右時，紅曲霉發(fā)酵液中幾乎無法檢測到桔霉素的生物合成，Kang B等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中的pH值變化可以調(diào)節(jié)桔霉素的生物合成，在極低的初始pH條件下不會合成桔霉素。Xiong Xu等[24]以玉米粉∶小麥淀粉(30∶30，g/L)為底物，玉米、小麥等農(nóng)作物具有良好的緩沖性，在紅曲霉發(fā)酵過程中使pH保持在2.6～3，桔霉素在TLC分析中未檢測到。另一方面，Chen等[25]研究紅曲霉本身具有代謝桔霉素的能力，當溫度相對較高時紅曲霉能分解桔霉素進行再次利用，最終導(dǎo)致22.5～30 ℃時桔霉素依次降低。

圖3 不同發(fā)酵溫度對桔霉素含量的影響 Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on citrinin content

3 結(jié)論

低溫條件改變紅曲霉GN發(fā)酵過程中的pH值，研究低溫條件對紅曲霉GN生物合成紅曲黃色素及桔霉素的影響。低溫條件下改變紅曲霉發(fā)酵過程的pH值，使終止pH處于2.8～4.4，在此pH值下有利于紅曲色素的生物合成，但也有利于桔霉素的生物合成。20 ℃時發(fā)酵終止pH值為2.89(pH<3)，表現(xiàn)為抑制紅曲黃色素及桔霉素的合成代謝，此時的紅曲黃色素和桔霉素表現(xiàn)為急劇降低，22.5 ℃時紅曲色素的合成量達到最大值，但桔霉素的合成量也達到了最大值，而在25 ℃時，紅曲色素的含量與22.5 ℃時接近，桔霉素含量卻與20，27.5，30 ℃時相差不大，相較于其他溫度，25 ℃更適合紅曲黃色素的發(fā)酵生產(chǎn)。