郝 玲，戚穗堅(jiān)

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

乳腺癌是女性中的頭號(hào)殺手，臨床上雖然有多種的治療手段，但大多存在較大的毒副作用[1-3]。例如，傳統(tǒng)的化療對(duì)腫瘤組織缺乏選擇性，容易對(duì)全身正常組織以及免疫功能產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，并產(chǎn)生腫瘤耐藥現(xiàn)象[4]。研究具有低毒副作用并能有效抑制惡性腫瘤的替代手段具有十分重要的意義。對(duì)于某些惡性腫瘤的治療，腫瘤治療電場(chǎng)成了一種新的選擇[5-6]。但這種治療一般需使用外加電源，不僅使用不方便，而且還因插入電極而帶來(lái)組織損傷。鈮酸鉀鈉(KNN)是典型的無(wú)鉛壓電材料，具有優(yōu)越的壓電常數(shù)(較大的d33值)和較高的居里溫度，它能在遠(yuǎn)程超聲作用下產(chǎn)生內(nèi)在電場(chǎng)進(jìn)而作用細(xì)胞調(diào)控其行為[7-8]。研究其產(chǎn)生的內(nèi)在電場(chǎng)對(duì)惡性腫瘤的潛在抑制作用可望為癌癥的治療提供方便有效、低毒副作用的替代方案。本文通過(guò)水熱合成法制備了尺寸及電學(xué)特征可控的壓電鈮酸鉀鈉顆粒(P-KNN)，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，研究了在超聲輔助下其生物相容性以及對(duì)兩種不同乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

無(wú)水乙醇，五氧化二鈮，碳酸鉀，碳酸鈉，CCK-8及細(xì)胞活死染色試劑盒；

球磨機(jī)，烘箱，馬弗爐，高壓反應(yīng)釜，離心機(jī)，超聲機(jī)，酶標(biāo)儀。

1.2 樣品制備

通過(guò)水熱合成法制備P-KNN[9]。具體如下，以200 mL無(wú)水乙醇預(yù)先混合五氧化二鈮34.262 g，碳酸鉀6.831 g和碳酸鈉8.907 g，進(jìn)行球磨8 h。將球磨所得的混合液取出置于80 ℃烘箱至完全烘干(一般為12 h)。烘干后的樣品轉(zhuǎn)移至坩堝，放入馬弗爐中以750 ℃煅燒2 h，制得粉體；取出0.02 mol的粉體與50 mL去離子水進(jìn)行共混后轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯密封的高壓反應(yīng)釜中，于210 ℃下反應(yīng)24 h后，取出靜置12 h；棄上清，沉淀物攪拌混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心20 min；將上清液倒掉后加入30 mL的無(wú)水乙醇，將離心管密封好后放入超聲機(jī)中分散10 min，隨后將其放入離心機(jī)中以同樣的條件進(jìn)行再次離心。離心后，倒掉上層無(wú)水乙醇后加入去離子水清洗兩次；將清洗后的樣品放入80 ℃烘箱烘干，制備出P-KNN。

分別以?huà)呙桦娮语@微鏡(SEM)、能譜儀(EDS)、粒度分析儀、X射線(xiàn)衍射分析儀(XRD)和拉曼圖譜(Raman)分別對(duì)材料的表面形貌、元素組成、粒徑分析、物相分析和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用三種細(xì)胞株：具有高轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231；低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7以及人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A。每種細(xì)胞在各自官方推薦的最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。采用CCK-8試劑以及細(xì)胞死活染色法研究材料對(duì)正常乳腺上皮細(xì)胞的生物相容性以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。具體如下，將細(xì)胞接種于孔板中，待細(xì)胞完全貼附后分別與200，400 μg/mL的材料溶液共培養(yǎng)；超聲組每隔12 h超聲處理2 min，并于材料加入后24 h，36 h，48 h分別以CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞存活率。另外，在材料加入24 h后以試劑盒進(jìn)行死/活染色，于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，在同一位置同時(shí)觀察發(fā)綠色熒光的活細(xì)胞與紅色熒光的死細(xì)胞并進(jìn)行拍照，采用Image J軟件進(jìn)行處理。用transwell試驗(yàn)檢測(cè)材料對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響，通過(guò)倒置熒光顯微鏡明場(chǎng)觀察transwell小室下層過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量并進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征分析

通過(guò)XRD分析材料的晶體結(jié)構(gòu)，如圖1(a)所示，表明制得的材料為ABO3型鈣鈦礦結(jié)構(gòu)，在45度角附近出現(xiàn)(002)與(200)雙峰，表明四方相與正交相共存，制備的顆粒具有良好的壓電性。利用Raman分析材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在265 cm-1位置及621 cm-1位置均有KNN特征振動(dòng)峰的出現(xiàn)(圖1(b))。EDS分析表明材料的主要成分為氧、鈉、鈮、鉀元素(圖1(c))。

圖1 P-KNN的XRD(a)，Raman(b)和EDS(c)Fig.1 XRD(a),Raman(b)and EDS(c)of P-KNN

圖2 P-KNN的SEM(a)和納米粒度(b)分析Fig.2 SEM image(a)and DLS analysis(b)of P-KNN

利用SEM對(duì)材料的形貌進(jìn)行觀察，如圖2(a)所示，P-KNN呈現(xiàn)顆粒狀，材料具有較好的分散性，大小均一。進(jìn)一步通過(guò)粒徑分析表明P-KNN顆粒的大小約457.4 nm(圖2(b))，分布系數(shù)(PDI)為0.422，表明樣品的粒徑分布較窄，具有良好的分散性。

綜上表明，水熱合成法成功制備具有壓電特性的P-KNN，具有微納米級(jí)的粒徑大小且具有良好的分散性。

2.2 材料對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

采用CCK-8活性檢測(cè)法在材料加入后24 h，48 h，72 h進(jìn)行2種不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞活性的檢測(cè)。由圖3(a)可見(jiàn)，在不施加超聲下，與對(duì)照組相比，濃度為200，400 μg/mL的P-KNN對(duì)MDA-MB-231的存活率均具有一定的抑制作用；在施加超聲下，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率進(jìn)一步明顯受到抑制，在24 h時(shí)，400 μg/mL的P-KNN下MDA-MB-231的存活率僅約30%。當(dāng)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，72 h，結(jié)果表明，每個(gè)組別的細(xì)胞存活率都得到進(jìn)一步的抑制。材料以及超聲處理對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響與MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)果呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)(圖3(b))。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明P-KNN的作用以及超聲的刺激都能明顯的對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行抑制，且在P-KNN濃度為400 μg/mL并加超聲處理時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。

圖3 施加/不施加超聲下不同濃度P-KNN對(duì)MDA-MB-231(a)與MCF-7(b)細(xì)胞的毒性作用Fig.3 Cytotoxic effects of different concentrations of P-KNN on MDA-MB-231(a)and MCF-7(b)w/o ultrasound

進(jìn)一步采用細(xì)胞死活染色考察材料以及超聲作用對(duì)MDA-MB-231和 MCF-7細(xì)胞的抑制作用。超聲組在材料加入12 h后進(jìn)行超聲處理，24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行死活染色，活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色的熒光而死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色的熒光。結(jié)果顯示(此處未附上顯色圖)，對(duì)于兩種乳腺癌細(xì)胞，在不加材料不加超聲處理的空白對(duì)照組，細(xì)胞均為活細(xì)胞(綠色熒光)。在不施加超聲下，當(dāng)細(xì)胞與400 μg/mL的P-KNN作用后，死細(xì)胞(紅色熒光)出現(xiàn)；進(jìn)一步施加超聲下，大量的死細(xì)胞出現(xiàn)。綜上表明，在超聲輔助下，材料能夠產(chǎn)生非常顯著的乳腺癌細(xì)胞抑制效果，此結(jié)果也與上述CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.3 材料對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力的影響

Transwell試驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，超聲的刺激與P-KNN材料的作用都能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞的遷移侵襲能力產(chǎn)生顯著的抑制作用。在超聲的輔助下(P-KNN-400+US組)，材料的作用能夠完全抑制MDA-MB-231和 MCF-7兩種乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，原因可能是由于一方面材料和超聲的同時(shí)作用造成了癌細(xì)胞的大量死亡，另一方面存活的細(xì)胞由于其本身的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的改變甚至破壞，細(xì)胞也基本喪失了運(yùn)動(dòng)的能力。

圖4 施加/不施加超聲下400 μg/mL P-KNN對(duì)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的遷移侵襲實(shí)驗(yàn)Fig.4 The migration and invasion assays of MDA-MB-231 and MCF-7 co-cultured with 400 μg/mL P-KNN w/o ultrasound

2.4 材料的生物相容性

CCK-8活性檢測(cè)的結(jié)果表明(圖5)，在不施加超聲下，正常乳腺細(xì)胞MCF-10A與不同濃度的P-KNN溶液共培養(yǎng)后48 h后，細(xì)胞的存活率均在93%以上，表明KNN具有良好的生物相容性。而在施加超聲下(+US)，細(xì)胞的存活率雖有一定降低，但MCF-10A的細(xì)胞存活率仍能達(dá)到75%以上，表明KNN對(duì)正常乳腺細(xì)胞毒性作用較低。

圖5 施加/不施加超聲下不同濃度P-KNN對(duì)MCF-10A細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用Fig.5 Cytotoxic effects of different concentrations of P-KNN on MCF-10A w/o ultrasound

細(xì)胞死活染色(此處未附上顯色圖)結(jié)果與CCK-8定量結(jié)果一致，在不施加超聲下，與不同濃度的P-KNN共培養(yǎng)后MCF-10A顯示良好的細(xì)胞活性，出現(xiàn)很少死細(xì)胞(紅色熒光)；在施加超聲下，僅有少量紅色的死細(xì)胞出現(xiàn)。綜上結(jié)果說(shuō)明P-KNN具有良好的生物相容性，施加超聲刺激會(huì)造成細(xì)胞的少量死亡，但對(duì)比以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在具有顯著乳腺癌細(xì)胞抑制作用的P-KNN-400+US組，正常乳腺上皮細(xì)胞的存活率仍然能夠達(dá)到75%以上。

3 結(jié) 論

本研究制備具有壓電性能的鈮酸鉀鈉顆粒，研究其在超聲輔助下在體外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與遷移的潛在能力。通過(guò)對(duì)樣品的形貌、物相、化學(xué)結(jié)構(gòu)等的分析，證實(shí)獲得了分散性良好、尺寸均一的壓電性鈮酸鉀鈉顆粒(P-KNN)；通過(guò)細(xì)胞的活性檢測(cè)表明，400 μg/mL P-KNN在超聲的輔助作用下能夠達(dá)到對(duì)兩種不同乳腺癌細(xì)胞高達(dá)70%左右的抑制作用，對(duì)這兩種乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲具有明顯的抑制作用。而另一方面，材料以及超聲的作用并沒(méi)有給正常乳腺上皮細(xì)胞帶來(lái)明顯的毒性作用。此研究為進(jìn)一步研究具有壓電性能的生物相容性材料用于癌癥治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。