王麗麗，程 飛，張娜娜，鄭雪梅，張吉泉,，陳 瑞

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)/貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；2 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

癌癥(又稱惡性腫瘤)的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的《2020全球癌癥報告》顯示，2018年全球新增癌癥并列1810萬例，死亡960萬例。其中，我國新增癌癥病例380.4萬例、死亡229.6萬例[1]。相比于其他國家，我國癌癥的發(fā)病率和死亡率位列全球首位。因而，抗腫瘤藥物的研發(fā)面臨巨大的臨床需求。

靶向磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路成為近年來抗腫瘤創(chuàng)新藥物研究的熱點[2-3]。化合物PT-46是課題組前期研究得到的取代苯并咪唑抗腫瘤活性優(yōu)選化合物(圖1)，是一個PI3K/mTOR雙靶點抑制劑[4]。該化合物在HCT116細胞上具有較高的抗增殖活性(IC50值為0.3 μM，為陽性對照PF-05212384的4.67倍)[4]，是一個值得進一步研究和開發(fā)的抗腫瘤優(yōu)選化合物。

圖1 PT-46的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of PT-46

藥物主要是在肝臟里面代謝，其中細胞色素CYP(P450)酶是其主要的代謝酶，主要包含的CYP3A4、2C19、2C9、2D6、1A2酶參與了體內(nèi)大約80%以上的藥物代謝[5-7]。CYP酶是一個多功能的酶系，在體內(nèi)具有可抑制性和可誘導(dǎo)性。藥物與藥物相互作用能夠在體內(nèi)的所有過程(主要包括吸收、分布、代謝和排泄)中發(fā)生，其中在代謝過程中尤為明顯，約占40%[8-9]。所以藥物對于CYP酶的抑制作用研究是必不可少的，也是藥物在臨床前研究的重要一步，可為藥物臨床研究提供誘導(dǎo)效果與抑制效果的相關(guān)信息[10]。研究體外藥物代謝與藥物相互作用時最常采用肝微粒體法，該方法具有操作簡單、重復(fù)性好等的特點[11]。

鑒于PT-46新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)及良好的抗增值活性，本次實驗采用肝微粒體法，運用Cocktail探針底物法研究PT-46對體外人肝微粒體中5種常見CYP酶的抑制作用，進而了解潛在的藥物相互作用，旨在為后期該化合物的臨床前研究或新藥研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

X1型高速離心機，香港基因有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海邦西儀器科技有限公司；FA805N型十萬分之一電子天平，上海菁海儀器有限公司；DW-86L486型超低溫保存箱，海爾集團公司；優(yōu)普系列超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；KH-600E型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Xevo G2-XS型UPLC-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，美國Waters公司。

1.2 藥品與試劑

PT-46(純度：>98%，批號：20201026)，貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點實驗室制備；5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲、6β-羥基睪酮等對照品(批號：1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、KIT0635，純度≥98%)，加拿大TRC公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-P-DH，批號：20160725)，北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，濃度0.01 mol/L，pH7.4，批號：409L024)，北京索萊寶科技有限公司；右美沙芬對照品(批號：01155029-75469A，純度≥98%)，上海泰坦科技股份有限公司，非那西丁對照品(批號：81105，純度>98%)，美國Sigma公司；奧美拉唑、甲苯磺丁脲、睪酮、對乙酰氨基酚、(+)-N-3-芐基香酚、奎尼丁、磺胺苯吡唑、酮康唑和α-萘黃酮等對照品(批號：100367-201305、100369-201307、L31J8T40939、SJ0711GA14、L27J9B64115、J09M6B1、A22M10L83645、100294-201203、B20083，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；右啡烷對照品(批號：FK-J1795，純度>98%)，上海樊克生物科技有限公司；葡萄糖-6-磷酸-二鈉(G-6-P-Na2，批號：116B039)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸二鈉(NADP-Na2,批號：718B0225)、葛根素對照品(內(nèi)標，純度：>98%，批號：528C021)；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純，檸檬酸鈉、氯化鎂等其余試劑均為實驗室常用規(guī)格或分析純，水為蒸餾水。

2 方 法

2.1 PT-46和內(nèi)標溶液的制備

精密稱取適量PT-46化合物，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為5.0 mmol/L的貯備液，同法制得質(zhì)量濃度為10 μmol/L內(nèi)標溶液(含葛根素)，放置在4 ℃下保存，備用。使用前，將PT-46貯備液用甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的溶液。

2.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)輔酶溶液的制備

依次稱取200 mg G-6-P-Na2、200 mg NADP-Na2和133 mg 氯化鎂，用水溶解，溶解后定容至10 mL，放置在-20 ℃下保存?zhèn)溆?，記為A液。依次稱取44 mg 1 000 U G-6-P-DH和檸檬酸鈉，用水溶解，溶解后定容至25 mL，放置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?，記為B液。使用時，將AB兩液按體積比5:1分別加入至孵育體系中。

2.3 混合探針底物溶液的制備

參照文獻方法，精密稱取4.32 mg奧美拉唑、7.557 mg非那西丁、12.3 mg右美沙芬、7.21 mg睪酮、13.5 mg甲苯黃丁脲，用甲醇溶解各底物并定容至10 mL作為探針底物貯備液。使用前，精密吸取上述探針底物的貯備液1.0 mL于5.0 mL量瓶中，氮氣吹干，加入80 μL甲醇和20 μL DMSO溶解混合底物，最后再用0.1 mol/L PBS定容至5 mL。此時，混合探針底物溶液中奧美拉唑、非那西丁、甲苯黃丁脲、睪酮、右美沙芬的質(zhì)量濃度分別為1000、1500、1000、500、250 μmol/L。

2.4 特異性抑制劑的制備

分別稱取適量α-萘黃銅(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-芐基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4)，用甲醇溶解稀釋制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一貯備液。臨用時，用甲醇分別配制為質(zhì)量濃度為0.136、0.157、0.088、0.162、0.266 mg/mL備用。

2.5 肝微粒體體外孵育體系的建立

取人肝微粒體適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，孵育終體系為200 μL(100 mmol/L PBS)。取20 μL人肝微粒體于反應(yīng)體系中，分別加入110 μL PBS、20 μL PT-46或特異性抑制劑、30 μL NADPH輔酶溶液(A液25 μL，B液5 μL)，在冰浴中操作；迅速放入37 ℃水浴鍋中，孵育3 min，加入20 μL混合探針底物溶液開始反應(yīng)，反應(yīng)時間為60 min，平行3組。確保孵育體系中溶解探針藥物的DMSO含量不超過0.1%，甲醇含量不超過1%。反應(yīng)結(jié)束后加入200 μL冰乙腈(含10 μmol/L)讓反應(yīng)終止，渦旋儀渦旋60 s，在13000 r/min下離心10 min，取上清液，氮氣(N2)流吹干，殘留物用200 μL甲醇進行復(fù)溶，再13000 r/min下離心10 min，取適量上清液進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析。

2.6 UPLC-MS/MS法檢測

2.6.1 色譜與質(zhì)譜條件色譜條件

AC QUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm× 100 mm，1.8 μm)；流動相：0.01%甲酸水-0.01%甲酸乙腈，梯度洗脫(見表1)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正負離子靈敏度模式，數(shù)據(jù)采集范圍質(zhì)荷比(m/z)100～1200，毛細管電壓為2.0 kV(正模式)、1.5 kV(負模式)，脫溶劑的溫度：400 ℃(正模式)、450 ℃(負模式)，離子源溫度：120 ℃(正模式)、110 ℃(負模式)，碰撞氣：氮氣，霧化氣：氬氣，錐孔氣流量：50 L/h，脫溶劑氣流量：800 L/h。采用亮氨酸腦啡肽(1 ng/mL)和甲酸鈉(0.5 mmol/L)分別進行質(zhì)量軸的校正和質(zhì)量數(shù)的實時校正。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometer conditions

2.6.2 方法學(xué)考察

2.6.2.1 專屬性

取人肝微粒孵育液，除不加探針藥物和內(nèi)標外，其余按“2.5”項操作，獲得空白樣品色譜圖A；將一定濃度的代謝物標準溶液和內(nèi)標溶液加入滅活的人肝微粒體孵育液，同上操作得色譜圖B。

2.6.2.2 線性

分別取適量羥甲基苯磺丁脲、6β-羥基睪酮、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、對乙酰氨基酚單一貯備液，用甲醇稀釋成羥基甲苯磺丁脲質(zhì)量濃度分別為0.15、0.30、0.61、1.22、2.44、4.88 μmol/L，6β-羥基睪酮質(zhì)量濃度分別為3.67、7.34、14.68、29.34、58.68、117.37 μmol/L，5-羥基奧美拉唑質(zhì)量濃度分別為0.10、0.19、0.38、0.77、1.54、3.09 μmol/L，右啡烷質(zhì)量濃度分別為0.36、1.44、4.32、8.64、17.28、34.56 μmol/L，對乙酰氨基酚質(zhì)量濃度分別為0.26、0.52、1.04、2.09、4.18、8.35 μmol/L的系列溶液，按“2.5”項下方法處理后進樣進行測定，記錄各峰面積。以上述成分質(zhì)量濃度(x，μmol/L)為橫坐標、與其內(nèi)標峰面積之比(y)為縱坐標進行線性回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 鼠肝微粒體孵育體系中5種代謝物的線性Table 3 Linearity of 5 metabolites in mouse liver microsome incubation system

注：1.對乙酰氨基酚；2.右啡烷；3.6β-羥基睪酮；4.5-羥基奧美拉唑；5.葛根素；6.羥基甲苯磺丁脲圖2 總離子流圖Fig 2 Total ion chromatograms

2.6.2.3 準確度、基質(zhì)效應(yīng)、精密度以及穩(wěn)定性

分別配制含有對乙酰氨基酚等5種代謝物的孵育體系的低、中、高3個濃度質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度平行重復(fù)5個樣品，按“2.5”項下方法處理樣品后進樣分析，考察精密度和準確度；取空白肝微粒體的孵育體系200 μL，置于2 mL Ep管內(nèi)，按“2.5”項下方法處理，氮氣流吹干后，各用質(zhì)量濃度低、中、高的對乙酰氨基酚等5種代謝物對照品溶液200 μL復(fù)溶，每個濃度平行5份，計算各代謝物與內(nèi)標峰面積比值(Ⅰ)與同樣濃度的5種代謝物對照品溶液直接進樣獲得的峰面積(Ⅱ)的比值，考察基質(zhì)效應(yīng)。上述樣品處理后室溫放置12 h后進樣分析，考察樣品穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 5種代謝物在人肝微粒體孵育體系中的準確度、基質(zhì)效應(yīng)、精密度以及穩(wěn)定性測定結(jié)果(n =5)Table 4 The results of accuracy,precision,matrix effect and stability of the five metabolites(n = 5)

2.7 體外孵育試驗

體外孵育試驗設(shè)置陽性對照組、空白組、試驗組，每組各平行3組。按“2.5”項下方法制備孵育體系，其中，試驗組的孵育體系中分別加入質(zhì)量濃度分別為5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的PT-46溶液使得孵育體系含PT-46的終濃度為 50.0、15.0、5.0、1.5、0.5、0.15、0.05 μmol/L，陽性對照組的孵育體系中分別加入“2.4”項下的α-萘黃銅(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-芐基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4)特異性抑制劑；空白組孵育體系中加入等體積的PBS緩沖液。測試CYP450特異性底物代謝產(chǎn)物的含量：CYP1A2(對乙酰氨基酚)、CYP2D6(右啡烷)、CYP2C19(5-羥基奧美拉唑)、CYP2C9(羥基甲苯磺丁脲)和 CYP3A4(6β-羥基睪酮)計算出的CYP1A2、2D6、2C19、2C9、3A4的IC50，用以評價化合物PT-46對CYP450 活性的抑制影響。

按“2.5”項下孵育體系進行孵育測定生成的各代謝產(chǎn)物濃度，將其與空白樣品(未添加PT-46的樣品)的代謝的產(chǎn)物濃度進行比較，可以得到酶剩余活性，之后以PT-46濃度為橫坐標，酶剩余活性為縱坐標，運用 GraphPad Prism 5.0軟件進行非線性擬合，作圖并計算出IC50值。IC50=藥物剩余濃度/藥物濃度。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性

結(jié)果表明，待測物對乙酰氨基酚、右啡烷、5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲和內(nèi)標葛根與空白肝微粒無干擾，專屬性良好。

3.1.2 線性

5種代謝物的線性范圍、線性方程如表3所示，大鼠肝微粒體孵育體系中待測物質(zhì)的線性關(guān)系良好，各成分相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

3.1.3 準確度、基質(zhì)效應(yīng)、精密度以及穩(wěn)定性

結(jié)果表明，5種檢測物的準確度范圍86.68%～107.42%，基質(zhì)效應(yīng)范圍85.68%～109.88%，穩(wěn)定性范圍89.14%～99.65%以及精密度RSD小于10.0%，提示該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好。

3.2 PT-46對ACYP450 5個亞型的抑制作用

通過PT-46在人肝微粒體體外孵育，得出PT-6對CYP450各亞型的抑制效果。把PT-46的濃度作為橫坐標，酶剩余活性作為縱坐標，用Graphpad Prism 5.0軟件進行非線性回歸的分析，作圖并且計算得到IC50值。酶活性與濃度的擬合圖見圖3，PT-46對人肝微粒體CYP450 5個亞型的IC50值見表5。陽性對照品IC50值的結(jié)果見表6。

圖3 PT-46對人肝微粒體中CYP450酶5個亞型的抑制作用Fig 3 Inhibitory effects of PT-46 on five subtypes of CYP450 enzymes in human liver microsomes

表5 PT-46對人肝微粒體CYP450酶五個亞型的IC50值Table 5 IC50 values of PT-46 on five subtypes of human liver microsome CYP450 enzymes

表6 陽性對照對人肝微粒體CYP450酶五個亞型的IC50值，驗收范圍和是否通過Table 6 IC50 values,acceptable ranges and pass of five subtypes of human liver microsomal CYP450 enzymes in positive control

由圖3、表5及表6可知，在測定IC50的實驗中陽性對照組與CYP450的5個亞型的IC50值都在接受范圍當中，由此可顯示實驗中的孵育體系有效。PT-46在給出濃度范圍中對人肝微粒體中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4沒有抑制作用，對CYP2C9、CYP2C19存在一定的抑制作用，其IC50分別為19.6、19.2 μmol/L。

4 結(jié) 論

受代謝酶的影響和控制，藥物在體內(nèi)的相互作用、藥理活性以及代謝過程等方面存在明顯差異。由藥物代謝引起的藥物-藥物相互作用(Drug-Drug Interaction,DDI)發(fā)生率較高，導(dǎo)致嚴重 DDI 原因之一是藥物對 CYP450 酶的抑制作用[12]。近年來，隨著檢測方法的特異性和靈敏度的不斷提高，Cocktail探針藥物法在各個研究領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。Cocktail探針藥物法是指給予不同的劑量探針藥物，測定每種探針藥物代謝物生成率的方法[13-14]。優(yōu)選化合物PT-46具有優(yōu)異的體外抗腫瘤活性，研究其潛在的DDI效應(yīng)是非常必要的。本研究對PT-46在肝微粒體中的代謝行為進行了初步探討，采用Cocktail探針藥物法評價了PT-46在人肝微粒體CYP酶亞系中的CYP3A4、2E1、2C19、2C9、1A2的抑制作用，所使用方法靈敏、快速。研究結(jié)果顯示，PT-46對人肝微粒體中的2種亞型酶(CYP2C19和 CYP2C9)有著不同程度的抑制作用，并且呈濃度依賴性。該結(jié)果提示，在PT-46的后續(xù)研發(fā)中，應(yīng)著重關(guān)注其與CYP2C19及CYP2C9的底物、誘導(dǎo)劑或者抑制劑同時使用，可能誘發(fā)DDI效應(yīng)。