黃菊芳 蔣云霞 黎敏航 羅 婷 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧市 530011，電子郵箱：huang18376785146@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530001)

肝纖維化是在病毒性肝炎、乙醇、自身免疫以及藥物等各種致病因子作用下引起的肝內(nèi)慢性損傷和炎癥[1]，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)過度沉積，是各種慢性肝病發(fā)展的病理特征。肝纖維化的發(fā)展具有隱匿性，有效控制肝纖維化對預(yù)防肝硬化和肝癌具有重要作用。然而當(dāng)前臨床上仍然缺乏高效且無明顯毒副作用的抗肝纖維化西藥專藥，故從中醫(yī)藥寶庫中尋找有效抗肝纖維化的藥物具有重要的意義。

雞血藤為豆科木質(zhì)藤本植物密花豆的干燥藤莖，記載于《本草綱目拾遺》，其性苦、甘、溫，歸肝、腎兩經(jīng)，具有活血補血，調(diào)經(jīng)止痛，舒筋活絡(luò)功效[2]。研究表明，雞血藤具有抗氧化、降血脂、保護(hù)肝細(xì)胞、抗病毒等作用[3-5]，但是目前有關(guān)雞血藤用于抗肝纖維化的研究較少，且抗肝纖維化的分子作用機(jī)制尚不明確。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討雞血藤抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 篩選雞血藤的活性成分 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索雞血藤的所有化學(xué)成分，然后以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[6]，篩選雞血藤中的活性成分。然后利用 Perl 軟 件(https://www.perl.org/)對篩選出的活性成分的靶點進(jìn)行預(yù)測。

1.2 注釋雞血藤的靶點基因 針對1.1中篩選出的靶點，利用UniProt在線蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查找對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)靶點基因名，從而對雞血藤的靶點基因進(jìn)行注釋，刪除UniProt數(shù)據(jù)庫中未查詢到基因名的靶點。

1.3 篩選雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點 以“Liver fibrosis”為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索疾病靶點，從而得到肝纖維化的疾病靶點。利用微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)構(gòu)建韋恩圖，從而將疾病靶點與篩選出來的雞血藤活性成分靶點進(jìn)行比對并取交集，最終獲得雞血藤作用于肝纖維化的潛在作用靶點。

1.4 構(gòu)建藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建雞血藤活性成分-肝纖維化靶點網(wǎng)絡(luò)，運用Cytoscape插件Network Analyzer計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，設(shè)置節(jié)點的形狀、大小以及顏色透明度，根據(jù)節(jié)點和節(jié)點之間的作用強(qiáng)度調(diào)節(jié)邊的粗細(xì)，并得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。

1.5 構(gòu)建雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點導(dǎo)入在線軟件STRING 11.0，設(shè)定研究物種為“homo sapiens”，下載“string_interactions.tsv”文件，并將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化分析處理，構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein,interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。其中，度值(Degree)反映節(jié)點的中心屬性，即靶點的顏色越深、面積越大，則度值越高；連線的粗細(xì)表示節(jié)點與節(jié)點之間的相互作用，線條越粗則代表節(jié)點之間的關(guān)系越密切。

1.6 基因功能和通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，針對雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)生物學(xué)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,根據(jù)P≤0.01篩選出前10名GO生物學(xué)功能和KEGG通路。利用R語言軟件構(gòu)建KEGG通路分析的柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 雞血藤的主要活性成分 共搜索到雞血藤有效成分68個，相關(guān)靶點1 142個。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)去重篩選，共獲得主要活性成分24個，對應(yīng)的靶點56個。見表1。

表1 雞血藤的主要活性成分

2.2 雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點 基于GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫，通過篩選去重得到肝纖維化的疾病靶點共6 899個，將雞血藤主要活性成分的靶點與肝纖維化的疾病靶點取交集，獲得共同的靶點49個(見圖1)，包括孕激素受體(progesterone receptor,PGR)、毒蕈堿膽堿能受體(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、γ-氨基丁酸A型受體α1亞單位(gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha 1,GABRA1)、乙醇脫氫酶1B(Ⅰ類)β多肽[alcohol dehydrogenase 1B(classⅠ),beta polypeptide,ADH1B]、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、腎上腺素受體α1A(adrenoceptor alpha 1A,ADRA1A)等靶點。

圖1 雞血藤-肝纖維化共同靶點的韋恩圖

2.3 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 將24個雞血藤有效活性成分以及49個雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點，構(gòu)建藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中共有74個節(jié)點通過219條邊發(fā)生作用，其中包括23個雞血藤主要活性成分節(jié)點(藍(lán)色箭頭)和49個肝纖維化的疾病靶點基因節(jié)點(紫色圓形)、疾病(橘色四邊形)、中藥(紫色三角形)。

圖2 雞血藤活性成分-肝纖維化疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與核心基因篩選結(jié)果 將雞血藤有效活性成分作用于肝纖維化的靶點導(dǎo)入在線軟件STRING 11.0，獲取蛋白互作數(shù)據(jù)，并利用Cytoscape 3.7.0軟件根據(jù)度值的大小進(jìn)行排列，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，此網(wǎng)絡(luò)共有48個節(jié)點(雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點)通過319條邊進(jìn)行相互作用。其中，雞血藤抗肝纖維化的潛在靶點度值排前5的靶點依次為表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)、癌組基因(MYC)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、雌激素受體(estrogen receptor,ESR)1和血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。利用Cytoscape軟件分析插件Node Degree Distribution，對雞血藤對肝纖維化作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，取靶點度值前30的靶點，見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果(Degree排前30的靶點)

2.5 雞血藤作用于肝纖維化的生物信息學(xué)分析 GO功能富集分析結(jié)果提示，雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點參與了154個生物學(xué)過程,包括凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞增殖等；23個細(xì)胞成分，包括細(xì)胞核、突觸、核漿、細(xì)胞質(zhì)等；46個分子功能，包括類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性與細(xì)胞凋亡的關(guān)系等。見表3。

表3 雞血藤對肝纖維化作用靶點的GO分析

共分析出101條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，前20條通路見圖4，其中包括前列腺癌信號通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號通路、乙型肝炎信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路等。

圖4 KEGG通路分析柱狀圖

3 討 論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的共同表現(xiàn)，是肝硬化以及肝癌必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，嚴(yán)重危害人類健康。研究表明，中醫(yī)藥在預(yù)防和抗肝纖維化中起到了一定的成效，單味中藥的提取物如莪術(shù)醇[7]、姜黃素[8]、川芎嗪[9]等都可通過不同的靶點或信號通路抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，從雞血藤中可提取到黃酮類、酚酸、香豆素、木脂素、萜、生物堿和甾體等活性成分[10-11]，這些活性成分可通過促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞凋亡[12]、抑制氧化應(yīng)激[13]起到保護(hù)肝臟的作用。但是目前有關(guān)雞血藤抗肝纖維化作用的研究較少，且雞血藤含有多種活性成分，其抗肝纖維化的主要成分及抗肝纖維化的作用機(jī)制尚不完全明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對雞血藤抗肝纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期闡釋雞血藤防治肝纖維化的主要成分及其作用靶點，為尋找和開發(fā)抗肝纖維化的藥物提供參考。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，得出雞血藤的主要活性成分24個和潛在的抗肝纖維化靶點49個；PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排前5位的靶點依次為EGFR、MYC、IL-6、ESR1和VEGFA，其與其他靶點發(fā)生的相互作用最多，提示這5個靶點是雞血藤抗肝纖維化的有效潛在靶點。研究表明，細(xì)胞因子通過刺激肝星狀細(xì)胞的活化和增生，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展[14]。其中，表皮生長因子受體屬于受體酪氨酸激酶的ErbB家族，在上皮細(xì)胞生理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體[15]。EGFR的表達(dá)升高與肝組織損傷和炎癥反應(yīng)延長有密切的聯(lián)系[16]，并參與肝纖維化的形成和發(fā)展[17]。MYC基因包括C-myc、N-myc、L-myc 3個家族成員[18]，C-myc在肝細(xì)胞中會誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的激活，促進(jìn)成肌纖維細(xì)胞分化增殖[19]，是慢性肝臟疾病的驅(qū)動力[20]，可導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化和肝腫瘤發(fā)生。雞血藤的有效活性成分可能主要通過調(diào)節(jié)上述肝細(xì)胞有害因子以及肝組織炎癥反應(yīng)(細(xì)胞因子)等來抑制肝纖維化的進(jìn)展。目前，尚無文獻(xiàn)報告IL-6、ESR1、VEGFA與肝纖維化的關(guān)系。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，雞血藤抗肝纖維化潛在的靶點主要參與凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞質(zhì)、突觸、核漿、細(xì)胞核等細(xì)胞成分，以及類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性與細(xì)胞凋亡的關(guān)系等分子功能；這些靶點可通過影響甾體激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體的活性、乙酰膽堿受體的活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等過程來調(diào)控肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，雞血藤抗肝纖維化潛在的靶點涉及的信號通路主要包括前列腺癌信號通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號通路、乙型肝炎信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、PI3K/Akt信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路等。其中，中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑在肝纖維化發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。Lei等[22]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減輕肝實質(zhì)損害，實現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。EB病毒也稱為人類皰疹病毒，是一種普遍存在的傳染性病原體，全球每年約有98%的人口被EB病毒感染[23]，而EB病毒是引起肝損傷甚至肝功能衰竭的病原體[24]，可誘發(fā)自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等疾病[25]。肝細(xì)胞持續(xù)損傷可導(dǎo)致肝硬化，而肝纖維化是肝硬化必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討雞血藤抗肝纖維化的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)雞血藤中的多種有效成分可作用于多種靶點和信號通路從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。但是，肝纖維化的病因多種多樣,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)胞外基質(zhì)及肝內(nèi)各種細(xì)胞均參與了肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,并且受限于各種數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)信息的更新不全，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于雞血藤抗肝纖維化的認(rèn)識還存在一定的局限性。如何進(jìn)一步闡明細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互關(guān)系,尤其是中醫(yī)藥在肝纖維化中的作用機(jī)制,為肝纖維化治療尋找特異性靶點,可能是今后研究的熱點和難點。