葉娜 張曉蘭 包鵬甲 王興東 閻萍 潘和平

（1. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

皮膚是哺乳動物中最大、最復(fù)雜的器官之一，主要由表皮及其附屬器官構(gòu)成［1］。小鼠表皮主要由不同生理功能的兩個(gè)部分組成，濾泡間上皮（interfollicular epithelium，IFE）和毛囊（hair follicle，HF），還包括皮脂腺（sebaceous gland，SG）［2］。濾泡間上皮細(xì)胞是構(gòu)成上皮細(xì)胞和扁平復(fù)層上皮的主要成分，在保護(hù)皮膚屏障功能方面起著關(guān)鍵作用［3］。毛囊的形成是表皮上皮和間質(zhì)真皮及其特殊衍生物真皮濃縮物（dermal concentrate，DC）、真皮乳頭（dermal papilla，DP）等相互作用并進(jìn)行信號傳遞的結(jié)果。成熟的HF結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由毛干和內(nèi)根鞘上皮細(xì)胞組成的同心環(huán)、隆起部儲備的干細(xì)胞以及毛球底部的基質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成［4-6］。胚胎期HF的形態(tài)發(fā)生經(jīng)歷誘導(dǎo)期、器官發(fā)生和細(xì)胞分化3個(gè)時(shí)期。出生后HF的生長會發(fā)生動態(tài)變化，并以周期性的方式持續(xù)下去。毛發(fā)生長周期可分為3個(gè)階段：休止期、生長期和退行期［7-10］，每個(gè)階段都受到特定遺傳模式的調(diào)節(jié)［11］。在毛發(fā)的生長階段，DP起著信號指導(dǎo)的作用［12-14］，促使轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)大祖細(xì)胞增殖、向上遷移并分化為幾層軸鞘和內(nèi)根鞘細(xì)胞系［14-15］。目前HF的復(fù)雜性還未得到充分的揭示，在HF周期性生長分子調(diào)控機(jī)制的研究中，多以多種類型組織（真皮、表皮、HF）等混合的皮膚做為起始樣本，沒有從中分離出勻質(zhì)性單細(xì)胞，這使得細(xì)胞之間相互作用的生物差異有可能被平均值所掩蓋或是被誤認(rèn)做為技術(shù)噪音。或僅對HF自身進(jìn)行了研究，而忽略了HF組織周圍真皮、表皮與HF互作對周期性生長的影響。但隨著技術(shù)的更新，HF的研究更上一個(gè)層次。有報(bào)道利用scRNA-seq對HF形態(tài)發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究［16-18］。亦有對小鼠成熟HF不同發(fā)育階段的空間調(diào)控機(jī)制的研究［19-20］。但HF發(fā)育調(diào)控機(jī)制上還有許多問題沒有解決，有待進(jìn)一步的研究。

由于技術(shù)限制，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序只能測得細(xì)胞群體中多數(shù)基因表達(dá)水平的“平均數(shù)據(jù)”，主要反映優(yōu)勢細(xì)胞亞群的生物學(xué)信息，而小細(xì)胞亞群的作用往往被忽視，從而可能掩蓋了這部分細(xì)胞所攜帶的重要信息［21］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模測序平臺使大量DNA和RNA分子同時(shí)測序成為可能，這為各個(gè)領(lǐng)域的研究人員同時(shí)研究生物體的遺傳信息和轉(zhuǎn)錄信息提供很大幫助。因此，利用全基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳修飾的數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的分析，對全面揭示基因表達(dá)調(diào)控的異質(zhì)性更為必要［22］。理解器官的發(fā)育和功能需要對其成分加以了解，即組成器官或組織的不同細(xì)胞類型。剖析器官的細(xì)胞組成類型或探索同一類型細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的理想方法是對樣本中隨機(jī)抽取的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)的分析。單細(xì)胞水平的分析方法包括RNA原位雜交，蛋白質(zhì)免疫染色，或熒光嵌合蛋白，都是基于細(xì)胞特異性表達(dá)的表面標(biāo)記物或熒光報(bào)告蛋白進(jìn)行，這些方法只能監(jiān)測每個(gè)試驗(yàn)中的少數(shù)基因。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種能夠獲得細(xì)胞中所有mRNA的單細(xì)胞水平的分析方法，它可對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無偏、高通量以及高分辨率的轉(zhuǎn)錄組測序分析。2009年，北京大學(xué)的湯富酬教授在Nature Methods上首次報(bào)道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的研究，從此掀開了單細(xì)胞測序技術(shù)的篇章［23］。scRNA-seq是通過二代測序技術(shù)（next generation sequencing）來識別單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)信息，分析細(xì)胞間遺傳和基因表達(dá)水平的差異，同時(shí)解決用組織樣本測序無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題，從而更好地了解單個(gè)細(xì)胞在微環(huán)境中的功能［24］，并可以揭示復(fù)雜和稀有的細(xì)胞群體以及基因之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，跟蹤不同細(xì)胞譜系在發(fā)育過程中的軌跡，揭示單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特性，進(jìn)而解決批量分析中無法解決的問題［25-26］。目前，scRNA-seq已被應(yīng)用于鑒別健康組織的細(xì)胞類型［27］、發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型［28-30］、探索發(fā)育生物學(xué)過程的動力學(xué)［31-32］、識別基因調(diào)控機(jī)制［33］，以及描述腫瘤的異質(zhì)性等［34-35］。本文就單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展、分離技術(shù)及其在HF發(fā)育調(diào)控研究中的應(yīng)用展開敘述，以期為揭示HF發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究提供理論參考。

1 scRNA-seq的發(fā)展歷程

scRNA-seq始于單細(xì)胞qPCR的發(fā)展，跟單分子FISH一樣，都是對轉(zhuǎn)錄物靶向分析的一種方法［36］。2009年，湯富酬首次報(bào)道單細(xì)胞測序的研究，但是該方法只適用于少數(shù)珍貴細(xì)胞基因表達(dá)的深度測序［23］，2011年，Islam等［37］研發(fā)了一種基于單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測序方法，即單細(xì)胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測序（single-cell tagged reverse transcription sequencing，STRT-seq），它是利用5′tag計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)錄本的單細(xì)胞方法之一，在microfluidigm C1平臺（STRT-C1）上進(jìn)行的STRT-seq是一種靈活的scRNA-seq方法，可在單細(xì)胞水平上對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行準(zhǔn)確、敏感和重要的分子計(jì)數(shù)［38］。隨后，Hashimshony等［39］又研發(fā)出CEL-seq（cell expression by linear amplification and sequencing），該方法克服了RNA在細(xì)胞中由于起始量小的局限，通過給樣本匯集條形碼來滿足IVT（in vitro transcription）線性擴(kuò)增對材料的要求，從而允許從單個(gè)細(xì)胞中高效線性擴(kuò)增RNA，同時(shí)通過測序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。擴(kuò)增后DNA的兩端深度測序能夠準(zhǔn)確檢測兩條鏈的序列，該方法比基于PCR的擴(kuò)增方法具有更高的重復(fù)性、敏感性，CEL-Seq支持轉(zhuǎn)錄組量化，將有助于不同細(xì)胞類型群體的復(fù)雜組織的轉(zhuǎn)錄組分析。這種方法的缺點(diǎn)是具有強(qiáng)烈的3′端偏好。2013年，Picelli［40］引入了Smart-seq2，該方法可以完整覆蓋轉(zhuǎn)錄本的全長，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體和SNV檢測，同時(shí)改進(jìn)了逆轉(zhuǎn)錄、模板轉(zhuǎn)換和前置擴(kuò)增等功能，以增加單個(gè)細(xì)胞生成的cDNA文庫的產(chǎn)量和長度。與Smart-seq［41］轉(zhuǎn)錄組庫相比，Smartseq2轉(zhuǎn)錄組庫在檢測、覆蓋率、偏倚和準(zhǔn)確性方面都有所提高，并且使用現(xiàn)成的試劑生成，成本更低，但其只能對具有poly（A）尾巴的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。2014年，Jaitin［27］研發(fā)的MARS-seq（massively parallel single cell RNA-seq）問世，它是一種自動化的大規(guī)模單細(xì)胞RNA測序方法，用于分析數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。2015年，哈佛大學(xué)的兩個(gè)團(tuán)隊(duì)開發(fā)出 inDrop［42］和 Drop-seq［43］兩種單細(xì)胞測序技術(shù)，兩種方法都是基于高通量液滴微流控裝置，將數(shù)千個(gè)細(xì)胞分離成納米大小的液滴，然后不同的條形碼再與每個(gè)細(xì)胞的RNA聯(lián)系起來并通過二代測序進(jìn)行后續(xù)分析。2017年，商業(yè)化的10×Genomics Chromium出現(xiàn)，該項(xiàng)技術(shù)由10×Genomics公司和Fred Hutchinson癌癥研究中心共同研發(fā)，它可實(shí)現(xiàn)大量細(xì)胞的快速標(biāo)記、測序與分析，并獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜和差異情況，通過對復(fù)雜的細(xì)胞群體進(jìn)行的細(xì)致分析，繪制大規(guī)模單細(xì)胞表達(dá)圖譜［44］。2017年，浙大教授開發(fā)了microwell-seq，一個(gè)使用簡單、廉價(jià)設(shè)備的高通量、低成本的scRNA-seq平臺，利用該平臺，該團(tuán)隊(duì)首次繪制出哺乳動物的細(xì)胞圖譜，還構(gòu)建了一個(gè)基于單細(xì)胞數(shù)字表達(dá)精確定義細(xì)胞類型的“單細(xì)胞MCA（ScMCA）”工具［45］。同年還有一種基于微孔陣列的Seq-Well技術(shù)，這是一個(gè)簡單、便攜、低成本的大規(guī)模并行的scRNA-seq平臺，它將單個(gè)細(xì)胞和條形碼mRNA捕獲珠密封在微孔陣列板中，從而實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞裂解和轉(zhuǎn)錄本捕獲［46］。另外還有一種基于組合標(biāo)記的SPLiT-seq［47］，該技術(shù)成本低廉，能夠在一次試驗(yàn)中對成千上萬個(gè)固定的細(xì)胞或細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析且不需要將單個(gè)細(xì)胞劃分為單獨(dú)的隔間（液滴、微孔），而是依賴于細(xì)胞本身作為隔間。測序的整個(gè)工作流程只包括移液步驟，不需要復(fù)雜的儀器。

2 單細(xì)胞制備

2.1 單細(xì)胞懸液準(zhǔn)備

單細(xì)胞分離是單細(xì)胞測序最關(guān)鍵的步驟，為了在下游分析過程中保持細(xì)胞的存活力，尋找溫和有效的單細(xì)胞分離方法非常必要。單細(xì)胞測序前需將組織解離為單細(xì)胞懸液，其分離方法多樣，一般用酶消化法，對于結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的組織多采用機(jī)械和酶組合的方式解離，比如毛囊單細(xì)胞的解離，對皮膚組織進(jìn)行清洗消毒后，剪成0.5 cm×0.2 cm的小長條用dispase酶消化2 h，在體式顯微鏡下拔出單根毛囊置于培養(yǎng)皿中，再添加0.25%胰蛋白酶消化0.5 h后經(jīng)反復(fù)吹打、過濾、離心制備成單細(xì)胞懸液。之后再通過清洗、稀釋、利用微流控或者是FACS對細(xì)胞進(jìn)行捕獲。為減少細(xì)胞聚團(tuán)，在酶消化過程中可加入DnaseⅠ消化核酸而不損傷完整的細(xì)胞。

在細(xì)胞捕獲前，原代解離的細(xì)胞懸液會存在一定的雜質(zhì)、較大的細(xì)胞碎片或者團(tuán)塊，一般采用孔徑大于最大細(xì)胞直徑的細(xì)胞篩過濾，過濾兩次，較小的雜質(zhì)可采用離心清洗來去除，離心過程中要使細(xì)胞匯集不能太緊實(shí)，而且上清液中的細(xì)胞要盡可能少，一般使用300×g，離心5 min［48］，由重力差細(xì)胞匯集到底部，雜質(zhì)會漂浮在上清液中，棄上清后用含0.04%牛血清蛋白無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行重懸，為盡量減少剪切力對細(xì)胞的損傷，一般采用寬移液管對細(xì)胞進(jìn)行重懸。細(xì)胞懸液制備好后，防止細(xì)胞放置時(shí)間長導(dǎo)致活率降低應(yīng)盡快完成后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單細(xì)胞的分離技術(shù)

近年來，眾多研究者對單細(xì)胞分離的方法進(jìn)行持續(xù)的探究和改進(jìn)，常用的單細(xì)胞分離技術(shù)有：有限稀釋法、熒光激活細(xì)胞分選、顯微操作技術(shù)、微流控技術(shù)和激光捕獲顯微切割技術(shù)（圖1）。

2.2.1 有限稀釋法 有限稀釋法（limiting dilution）多用于不同組織的干細(xì)胞或前體細(xì)胞的體外克隆分析，該方法將細(xì)胞懸液經(jīng)過一系列不同梯度稀釋，直至獲取單個(gè)細(xì)胞（圖1-a），憑借梯度稀釋計(jì)算，不能直觀的分選單細(xì)胞，這種方法對設(shè)備和操作的要求較小，操作簡單，成本低廉，但分離單細(xì)胞的成功率不高，對梯度稀釋的計(jì)算依賴性強(qiáng)，容易出現(xiàn)分離誤差或細(xì)胞丟失，耗時(shí)長，通量低，不能準(zhǔn)確地過濾靶細(xì)胞［49-51］。

2.2.2 顯微操作法 顯微操作法（micromanipulation）主要在目標(biāo)細(xì)胞稀少的情況下應(yīng)用，利用顯微操作儀聯(lián)合顯微鏡觀察，操作者選擇一個(gè)特定的細(xì)胞，近距離移動口吸管，并通過對口吸管施加吸力來對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行挑選，挑選出來再對其進(jìn)行更深一步的研究（圖1-b）。顯微操作主要用于培養(yǎng)細(xì)胞系或者是從早期胚胎中分離單個(gè)細(xì)胞。這種方法對細(xì)胞的活性和狀態(tài)影響較小，成本低，但容易造成RNA降解、通量低、投入人力較多，不利于規(guī)?；瘧?yīng)用［52-53］。

2.2.3 熒光激活細(xì)胞分選技術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)是一種通過單種或多種激光對PBS中的單個(gè)細(xì)胞或者離子快速分析的技術(shù)［54］（圖1-c）。流式細(xì)胞儀的熒光激活分選系統(tǒng)通過激光激發(fā)，被熒光抗體標(biāo)記物標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)過特定的激光束，再根據(jù)不同細(xì)胞接收的激光信號的偏轉(zhuǎn)情況捕獲單個(gè)細(xì)胞，該過程細(xì)胞懸浮液是通過流動細(xì)胞的壓力驅(qū)動的，細(xì)胞流迅速通過激光束被光激發(fā)，下游使用光學(xué)檢測器來捕獲細(xì)胞特定的信號而達(dá)到分選的目的。雖然實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，但是實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)成熟，且有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可供參考。該技術(shù)的準(zhǔn)確度和通量都很高，能快速檢測細(xì)胞的物理和化學(xué)參數(shù)；但是對懸浮細(xì)胞的數(shù)量要求較大（＞10 000），不適用于低豐度的細(xì)胞以及沒有表面標(biāo)記抗體和未知的細(xì)胞的分選。

2.2.4 激光捕獲顯微切割技術(shù) 激光顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection）是單細(xì)胞水平上對固體組織分析的有力工具，多用于從固定組織樣本中分離單個(gè)細(xì)胞［55］（圖1-d）?；驹硎窃陲@微鏡下使用UV（320-400 nm）激光選擇性地從冰凍或石蠟包埋組織切片熱塑膜的涂片上準(zhǔn)確的切割單細(xì)胞，但是該技術(shù)成本高、通量低、精度有限。細(xì)胞核很容易被切割掉，導(dǎo)致一些染色體片段在操作過程中丟失，切割過程中可能涉及原生質(zhì)體成份或相鄰細(xì)胞受損的細(xì)胞核，且分離過程中原始的RNA極容易降解，沒有全長分子用于反轉(zhuǎn)錄，RNA失去了它的完整性從而導(dǎo)致細(xì)胞群體出現(xiàn)偏差［56-57］。最近一項(xiàng)名為Smart-3SEQ［58］的新技術(shù)避免了該情況的出現(xiàn)，它結(jié)合了SMART［41］方法中的模板切換和Smartseq2［40］的優(yōu)化步驟采用 3SEQ［59］的 3′端表達(dá)定位法而產(chǎn)生一個(gè)非常簡單的程序。在3SEQ中，RNA在反轉(zhuǎn)錄之前被碎裂，這樣便消除了完整樣品和降解樣品之間的差異。反轉(zhuǎn)錄仍然是由錨定寡核苷酸（dT）引物啟動的，在每個(gè)轉(zhuǎn)錄物中，只有含poly（A）尾部起始的片段被測序。Smart-3SEQ與石蠟切片組織的相容性打開了大量存檔的臨床樣本，與LCM相結(jié)合，它允許對小細(xì)胞群體和原位分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行前所未有的研究［58］。

2.2.5 微流控技術(shù) 近年來，基于液滴技術(shù)的微流控或者芯片設(shè)備被開發(fā)出來用于單細(xì)胞的分離與分析［60-61］（圖1-e）。隨著微流控裝置的引入，迅速使其成為分離細(xì)胞的首選技術(shù)，相對于先前使用方法，它需要的試劑體積更小。在微流控器件中，流體動力通量使得細(xì)胞在幾十到幾百微米的通道中被分離和處理，此外，微流控設(shè)備還可以自動處理一些下游的RNA反應(yīng)，并允許測量和控制細(xì)胞外試劑濃度［62］。微流控技術(shù)（microfluidics）的基本原理是微液滴技術(shù)通常利用油相來剪切水相，形成表面活性劑穩(wěn)定的水液滴，兩種不混溶的流體在T型管中匯合時(shí)，來自水相的單細(xì)胞被包裹在液滴中，形成油包水的狀態(tài)［63］。該技術(shù)不僅可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的油包水液滴，而且可以提供獨(dú)立的分離室進(jìn)行單細(xì)胞分析，防止交叉污染。雖然基于液滴的單細(xì)胞分離取得了巨大的進(jìn)展，但要保證油包水中不超過一個(gè)細(xì)胞的封裝仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的方法是根據(jù)泊松分布使用有限的稀釋，這將導(dǎo)致單細(xì)胞的占用率低，且會出現(xiàn)大量的空液滴。為了最大限度地提高單細(xì)胞液滴的比例，可以在乳化前通過慣性聚焦均勻間隔單細(xì)胞，將單細(xì)胞占用效率提高到80%［63］。綜上所述，基于液滴的技術(shù)具有成本低、通量高、制作簡單、規(guī)模大、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在著單細(xì)胞含液滴率低、實(shí)時(shí)監(jiān)控不便的問題。

圖1 常用的單細(xì)胞分離技術(shù)部分引自[26]Fig. 1 Commonly used single cell isolation techniques Part cited from [26]

3 scRNA-seq不同測序方法比較

scRNA- seq方法可分為3個(gè)步驟進(jìn)行：（1）反轉(zhuǎn)錄；（2）cDNA擴(kuò)增；（3）測序文庫構(gòu)建。反轉(zhuǎn)錄非常關(guān)鍵，scRNA-seq的效果很大程度上取決于這一步的效率。反轉(zhuǎn)錄過程中，約有10%-20%轉(zhuǎn)錄本被成功的反轉(zhuǎn)錄為cDNA［64］，這就導(dǎo)致一些低表達(dá)量的基因無法被檢測到，從而引入較高的技術(shù)偏差，也即技術(shù)噪音（technical noise）。單細(xì)胞測序中，常以盡量減少操作和利用單管反應(yīng)來避免部分RNA損失，再用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA。除了基于引物設(shè)計(jì)的RNA測序DP-Seq［65］，為了防止捕獲核糖體RNA或轉(zhuǎn)移RNA占比較高的細(xì)胞RNA，一般使用poly（T）啟動來執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄，使用這個(gè)方法，非多聚腺苷酸化編碼蛋白質(zhì)的RNA不會被捕獲［66］。后來開發(fā)的SUPeR-seq彌補(bǔ)了這一缺陷，它被用于對單個(gè)細(xì)胞中的多聚嘌呤化和非多聚腺苷化RNA進(jìn)行測序［67］。該方法使用具有固定錨定序列的隨機(jī)引物（AnchorX-T15N6）代替常用的寡核苷酸（DT）進(jìn)行cDNA的合成。SUPeR-seq能檢測到單個(gè)細(xì)胞的多聚腺苷酸和非多聚腺苷酸RNA，且基因組DNA和rRNAs的污染可忽略不計(jì)［67］。但是該方法還沒有與除了Tang 2009以外的其他較廣泛使用的方法相比較。據(jù)后來報(bào)道稱MATQ-seq比Smart-seq2更為敏感和準(zhǔn)確［68］。MATQ-seq提供了完整的基因覆蓋和允許檢測總共RNA，這是一個(gè)很大的改進(jìn)，這種改進(jìn)是基于MALBAC（多重退火和循環(huán)擴(kuò)增循環(huán)）引物的使用。這些MALBAC引物包含27個(gè)常用序列，其后是5個(gè)隨機(jī)核苷酸，它們僅在3′端不同，分別為T20或G3/A3/T3，這樣大大提高了反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的效率。

反轉(zhuǎn)錄后，可以采用不同的方法合成第二鏈，一是SMART技術(shù)采用轉(zhuǎn)錄酶和M-MLV轉(zhuǎn)錄酶（小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶）的一鏈轉(zhuǎn)換活性將模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸作為下游PCR擴(kuò)增的接頭［69］。SC3-seq［70］、STRT-seq［71］、Smart-Seq2［40］三個(gè)平臺都是使用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR雖然是一種快速和廣泛使用的方法，但其缺點(diǎn)是會導(dǎo)致指數(shù)擴(kuò)增，使得高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物最終在文庫中被過度表達(dá)［72］。此外，由于對不同轉(zhuǎn)錄種的擴(kuò)增效率不同，PCR擴(kuò)增會造成定量偏差，導(dǎo)致原始轉(zhuǎn)錄物豐度信息的丟失和非特異性轉(zhuǎn)錄片段的積累。為了避免這一情況的出現(xiàn)，CEL-seq2［73］和 MARS-Seq［27］利用 IVT 線性擴(kuò)增來合成cDNA，通過在polyd（T）引物中加入T7啟動子，在第二鏈合成后進(jìn)行IVT?；パa(bǔ)RNAs要么被碎片化與3′端接頭連接，要么用隨機(jī)引物進(jìn)行另一輪反轉(zhuǎn)錄以提高敏感性（CEL-seq2）。與PCR相比，IVT優(yōu)勢在于線性擴(kuò)增，即使實(shí)驗(yàn)中對低表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的敏感性很低，它也不會以指數(shù)的形式消耗難以處理的序列。IVT比PCR工作強(qiáng)度更大，因?yàn)樗枰獙U(kuò)增的RNA進(jìn)行額外的一輪的反轉(zhuǎn)錄，這通常會導(dǎo)致提前終止和富集3′端RNA片段的積累（強(qiáng)烈的3′端偏好性），從而無法檢測到樣本完整的轉(zhuǎn)錄組信息［74-75］。以上涉及的單細(xì)胞測序技術(shù)均列表比較（表1）。

表1 單細(xì)胞測序技術(shù)匯總Table 1 Summary of single cell sequencing techniques

目前，大多數(shù)測序都是使用NextEra試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，Illumina平臺進(jìn)行測序，然而，擴(kuò)增后得到的cDNA文庫與所有平臺都兼容，比如：SC3-seq被設(shè)計(jì)使用SOLiD系統(tǒng)進(jìn)行測序［70］。最近使用唯一分子標(biāo)識符（UMIs）來改善scRNA-seq建庫，它在反轉(zhuǎn)錄過程中對細(xì)胞內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)的mRNA分子標(biāo)記上條形碼。從PCR復(fù)制標(biāo)簽產(chǎn)生的排序讀數(shù)將具有相同的隨機(jī)條形碼序列。因此，如果考慮到實(shí)驗(yàn)的初始RNA捕獲率（或效率），則給定細(xì)胞裂解物中轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)等于與映射到轉(zhuǎn)錄本的所有標(biāo)簽相關(guān)聯(lián)的UMI的數(shù)量。使用UMIs時(shí)的一個(gè)重要考慮因素是，為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本豐度的準(zhǔn)確量化，需要進(jìn)行飽和測序。到目前為止，最廣泛使用的方法是在反應(yīng)細(xì)胞裂解物中加入外部mRNA，這提供了關(guān)于分子輸入數(shù)量和觀察到的測序讀數(shù)之間的關(guān)系的信息。

4 scRNA-seq在HF發(fā)育研究中的應(yīng)用

scRNA-seq對揭示組織、器官以及胚胎的發(fā)育過程的異質(zhì)性具有很好的優(yōu)勢，HF的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，如果能夠通過高通量測序技術(shù)識別HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段不同細(xì)胞亞群的基因表達(dá)譜，從基因表達(dá)調(diào)控的整體特征上研究HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段的分子機(jī)制，篩選特異調(diào)控HF形態(tài)發(fā)生和周期性生長階段的調(diào)控元件或功能基因，從而揭示參與HF發(fā)育整個(gè)過程的細(xì)胞群體的異質(zhì)性，將對畜禽品種的培育以及治療人類毛發(fā)疾病具有很好的理論指導(dǎo)。利用scRNA-seq對HF的研究最早在2016年，Joost等［19］利用scRNA-seq對成年小鼠HF進(jìn)行測序，通過對休止期HF的1 422個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，聚類到25類不同轉(zhuǎn)錄水平的細(xì)胞亞群，解釋了表皮的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性是由表皮分化和HF近-遠(yuǎn)軸相關(guān)的基因表達(dá)模式的相互作用形成的，并揭示了形成表皮和HF的分化軌跡和空間特征。后來又運(yùn)用scRNA-seq和單分子RNA熒光原位雜交（FISH）對小鼠生長期和休止期HF的分子解剖學(xué)進(jìn)行研究，并得到56個(gè)表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞群的基因表達(dá)譜和空間位置，并揭示了協(xié)調(diào)毛發(fā)生長的細(xì)胞類型和狀態(tài)的分子機(jī)制、潛在的祖細(xì)胞譜系分化、成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性和上皮-基質(zhì)細(xì)胞的相互作用的細(xì)胞類型和狀態(tài)［20］。還有研究運(yùn)用scRNA-seq對絨山羊胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程進(jìn)行測序，鑒定到胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程中的主要細(xì)胞類型以及相關(guān)細(xì)胞的標(biāo)記基因，構(gòu)建了絨山羊真皮以及表皮細(xì)胞譜系在HF形態(tài)發(fā)生中的分化軌跡［77］。

4.1 發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞群

單細(xì)胞質(zhì)控完成后，相同類型的細(xì)胞一般具有相似的表達(dá)譜。因此可以通過表達(dá)相似性對細(xì)胞進(jìn)行聚類，從而將各細(xì)胞類型的細(xì)胞分離成獨(dú)特的細(xì)胞群。小鼠休止期HF單細(xì)胞測序研究人員［19］對其進(jìn)行兩個(gè)水平的聚類，一水平的聚類分為外凸（outer bulge）、內(nèi)凸（inner bulge）、毛囊上部（upper HF）、上皮基部（basal IFE）四大類，第二水平將這4類再進(jìn)行亞聚類，經(jīng)再次聚類upper HF分為7個(gè)亞群，其中5個(gè)是已知的（uHF III-VII），發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的細(xì)胞群（uHF I and uHF I）［19］。新的亞群位于皮脂腺開口的周圍，通過Rbp1表達(dá)以及Defb6和Cst6高表達(dá)來區(qū)分。接著研究人員又利用單細(xì)胞RNA測序和單分子RNA FISH來對小鼠生長期和休止期皮膚進(jìn)行了研究，作者鑒定出毛囊外根鞘（ORS）部分，并定義了3個(gè)細(xì)胞群。分別為Msx2 progency cluster（Msx2+）、Suprabasal outer layers cluster1（sbOL）、basal outer layers cluster2（bOL），其中后面兩個(gè)細(xì)胞群之前未報(bào)道過，在UMAP上，bOL和sbOL簇之間的表觀距離表明，這兩個(gè)細(xì)胞群體在成熟的生長期HF中是不通過中間狀態(tài)連接的。后面根據(jù)未剪接和剪接的mRNA的表達(dá)模式（RNA速率）來驗(yàn)證了這兩類細(xì)胞身份的動態(tài)［78］，并發(fā)現(xiàn)bOL和sbOL在生長后期是不同的細(xì)胞群，因?yàn)镽NA速率中并未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞簇之間有任何過渡跡象。這些新的發(fā)現(xiàn)揭示了ORS和內(nèi)部HF層如何協(xié)調(diào)頭發(fā)的產(chǎn)生。

4.2 發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)記基因

由于技術(shù)的更新，發(fā)現(xiàn)很多保守的標(biāo)記基因已經(jīng)不僅僅在特定組織中特異性表達(dá)，而是在不同類型的細(xì)胞中也能監(jiān)測到。在2015年，Sennett等［79］利用免疫熒光對不同類型的早期胚胎HF細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，通過流式分選，得到8個(gè)不同類型細(xì)胞群，經(jīng)RNA-seq測序建立了整個(gè)胚胎皮膚不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)了許多標(biāo)記基因。這是首次對HF形態(tài)發(fā)生過程中不同類型細(xì)胞的特異性分子進(jìn)行描述。流式分選對表面抗原標(biāo)記基因的保守性要求很嚴(yán)格，只有分選到高純度的目的細(xì)胞群才能反映其特異的基因表達(dá)譜。在當(dāng)時(shí)還沒發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞群體在分化過程中會經(jīng)歷不同的階段，因此這樣得到的特異性分子保守性并不高。

后來，該團(tuán)隊(duì)帶著DC特化的時(shí)間過程與祖細(xì)胞和信號傳遞之間的關(guān)系等問題進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)成像、流式分選、scRNA-seq和RNA-seq等方法根據(jù)特化過程中基因的動態(tài)變化和細(xì)胞在發(fā)育中的擬時(shí)序命運(yùn)的分子時(shí)間推移，定義了從Fb到DC前體的細(xì)胞命運(yùn)軌跡。DC特化過程總共經(jīng)歷了fibroblast、pre-DC、DC1以及DC2四個(gè)階段，但是在前面的研究中中間的分化階段是不存在的，技術(shù)的發(fā)展借助于單細(xì)胞測序，使得細(xì)胞之間的異質(zhì)性得以展現(xiàn)，且還發(fā)現(xiàn)了新的標(biāo)記基因，pre-DC階段的標(biāo)記基因有Smad3、Lef1和Twist2；DC1階段特異性表達(dá)Foxd1、Prdm1、Sox18和Trps1；DC2階段特異性表達(dá) Glis2、Foxp1、Alx4、Hey1 以及 Hes5［18，77］。葛偉［77］在研究絨山羊胚胎期HF形態(tài)發(fā)生過程中決定表皮與真皮細(xì)胞命運(yùn)的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄譜中發(fā)現(xiàn)絨山羊與小鼠的DC細(xì)胞特化過程的基因表達(dá)譜與分化階段是一致的，都依次經(jīng)歷fibroblast、pre-DC、DC1以及 DC2 四個(gè)階段［18］。

scRNA-seq在IFE和HF的亞型分類研究中具有較高的分辨率，可以區(qū)分基底和漏斗處干細(xì)胞群的靜止和中間細(xì)胞狀態(tài)［80］。毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）位于HF永久部分的下部的隆起區(qū)［5-6］，在哺乳動物的毛發(fā)周期中參與自我更新、遷移和分化。近期，研究者采用單細(xì)胞測序闡述HFSCs在生長中期自我更新的異質(zhì)性研究中，在主要類群中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由增殖細(xì)胞組成的亞群（Proli）不與任何凸起（Bu）或ORS種群聚集，并通過基因富集分析（GSEA）鑒定到新的標(biāo)記基因，分別為 Bu新標(biāo)記基因 Dmkn1、Crip1、Sostdc1、Ptn和Calml3；外根鞘上基底層（upORS-BL）新標(biāo)記基因Gnmt、Abi3bp、Edn2、Angptl4和Igfbp4；外根鞘下基底層（lowORS-BL）新標(biāo)記基因Tagln、Slc39a10、Acta2、Igfbp7和Rasl11a；外根鞘上基部（ORS-SB）新標(biāo)記基因 Pthlh、Ctsc、Mgst1、Wfdc18、Cldn［81］。這些標(biāo)記基因在未來可作為細(xì)胞消融、譜系追蹤和基因靶向研究的有力工具。

4.3 揭示HF發(fā)育過程的分化軌跡

單細(xì)胞基因表達(dá)研究使人們能夠?qū)?fù)雜的生物過程和高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體中涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步的認(rèn)知。HF的形態(tài)發(fā)生是一個(gè)連續(xù)的過程，在發(fā)育過程中經(jīng)歷了許多的中間分化狀態(tài)，而這些中間分化狀態(tài)最好的展現(xiàn)就是分化軌跡圖，分化軌跡的出現(xiàn)有利于發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞亞群在階段分化過程中的特異性表達(dá)基因。在對細(xì)胞的異質(zhì)性以及基因表達(dá)譜描述之后，利用細(xì)胞譜系關(guān)系構(gòu)建分化軌跡圖，細(xì)胞間的變化軌跡圖能清晰的反應(yīng)細(xì)胞隨著時(shí)間的變化過程，例如：在絨山羊胚胎期HF不同發(fā)育階段分化過程的細(xì)胞軌跡圖中表現(xiàn)出真皮譜系分化主要涉及DP和DC細(xì)胞的特化過程，而表皮細(xì)胞譜系分化主要涉及角化細(xì)胞、毛干細(xì)胞以及上皮細(xì)胞的特化過程［77］。細(xì)胞譜系關(guān)系在分化軌跡上呈現(xiàn)之后，就可以分析參與階段性分化過程的關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢，進(jìn)而挖掘到新的標(biāo)記基因。這樣也可以使我們對HF發(fā)育過程中細(xì)胞之間關(guān)系了解得更加透徹。

4.4 揭示HF發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子

HF發(fā)育的譜系分化過程經(jīng)分化軌跡圖展示以后，將進(jìn)一步探索整個(gè)命運(yùn)獲取過程中的基因表達(dá)譜和參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。上述的研究通過scRNA-seq分析建立從Fb到DC2的分化軌跡的偽時(shí)間排序后，單細(xì)胞擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)在pre-DC命運(yùn)獲取、DC1聚類和DC2毛發(fā)胚生長下降階段出現(xiàn)了3處基因上調(diào)的峰，這3處峰包含了許多的轉(zhuǎn)錄因子，比如在pre-DC階段，Lef1、Twist2、Smad3等顯著高表達(dá)。這表明這些因子在DC特化過程的pre-DC階段起到了關(guān)鍵作用。有報(bào)道稱，小鼠的Twist2基因敲除之后背部皮膚會出現(xiàn)毛發(fā)稀少，還伴隨著其他異常情況［82］，Lef1敲除則會導(dǎo)致胡須和背部毛囊無法形成［83］，為了驗(yàn)證這一結(jié)果，研究人員通過FISH證實(shí)了Twist2基因只在pre-DC階段的mRNA中表達(dá)，而在隨后的DC1階段卻不表達(dá)，這一結(jié)果更加證實(shí)了這些轉(zhuǎn)錄因子在階段表達(dá)中起到的重要作用。到了DC1階段中間表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括 Prdm1、Trps1、Sox18、Tshz1和 Foxd1。這一點(diǎn)與前人相關(guān)研究報(bào)道一致，Trps1基因的突變與阿姆布拉斯綜合征（一種高度變性疾病，表現(xiàn)為毛囊數(shù)量異常增多）高度相關(guān)［84］。Sox18在小鼠中的突變會影響真皮乳頭的分化［85］，另外，在DC2階段有許多特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，包括Hey1、Hes5、Glis2、Foxp1和Alx4。其中Foxp1是一個(gè)已知的在毛囊發(fā)育過程中維持HFSCs靜止（未分化）狀態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子［86］。通過以上的研究可知，scRNA-seq對HF發(fā)育研究是一個(gè)非常有利的工具。

5 展望

近年來，scRNA-seq技術(shù)取得了很大進(jìn)步，多種scRNA-seq平臺相繼問世。scRNA-seq的發(fā)展和創(chuàng)新很大程度上促進(jìn)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究，并為調(diào)控皮膚表皮和HF相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)特異性和動態(tài)平衡提供了更大的清晰度。原位雜交聯(lián)合單細(xì)胞測序的方法為我們對HF的研究帶來很大的便利，通過這些方法可以讓我們對研究方向有更進(jìn)一步的認(rèn)識，利用單細(xì)胞測序技術(shù)解析哺乳動物HF形態(tài)發(fā)生以及生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，對于治療人類毛發(fā)疾病也將有一定的借鑒意義。此外，隨著細(xì)胞條形碼和微流控技術(shù)的進(jìn)步，scRNA-seq的通量得到顯著增加。同時(shí)，對固定和冷凍樣品的scRNA-seq方法最近被提出，這將極大地有利于高度異質(zhì)性臨床樣品的研究。但是，目前可用的scRNA-seq方法仍然存在基因丟失率高的問題，這種情況下低表達(dá)的基因會在檢測過程中被遺漏。近些年隨著對HF單細(xì)胞由于分離技術(shù)限制性的克服，對HF單細(xì)胞水平的調(diào)控機(jī)制研究正在興起。我們相信不久的將來隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，一定會為HF發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制和動力學(xué)會提供更科學(xué)、深入的解析。