劉瑩 程立 張博

（南方科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，深圳 518055）

腫瘤、出生缺陷和自身免疫缺陷型疾病是全世界都面臨的難題，且這類疾病的致死率極高，嚴(yán)重威脅國民生命健康［1-2］。目前針對(duì)這類疾病還缺乏行之有效的治療手段，因此對(duì)這類疾病的早期檢測(cè)意義非凡。但目前可用的早期檢測(cè)方法十分局限：有創(chuàng)檢測(cè)方法［3-4］檢測(cè)率雖高但操作復(fù)雜且有較大副作用，一些生物標(biāo)記物［5-6］的檢測(cè)雖操作簡單但準(zhǔn)確率不高，因此建立一種無創(chuàng)、快速、準(zhǔn)確的早期檢測(cè)方法，對(duì)于提前檢測(cè)這類疾病，降低其死亡率、提高公眾健康水平具有重要的意義。

游離核酸（cell free DNA，cfDNA）最初是在人體外周血中發(fā)現(xiàn)，在過去的幾十年中從尿液、腦脊液和胸膜液中也提取出了cfDNA［7-10］。基于游離核酸的液體活檢技術(shù)因其無創(chuàng)性極大地減輕了患者檢測(cè)過程中的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，其結(jié)果分析基于核酸的測(cè)序技術(shù)，因此分析結(jié)果精準(zhǔn)且信息全面有說服力。與之相比，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)［11］等檢測(cè)技術(shù)成本較高，只能針對(duì)單一序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，通量低且難以實(shí)現(xiàn)全面的檢測(cè)；而基于血清標(biāo)志物［12］的檢測(cè)方法雖操作簡單，但僅對(duì)部分遺傳病有效，限制了其應(yīng)用范圍，且血清標(biāo)志物檢測(cè)的特異性有一定局限性。經(jīng)大量研究證明，來源于胎兒、腫瘤組織的cfDNA極大地促進(jìn)了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和液體活檢領(lǐng)域及其他潛在應(yīng)用的發(fā)展［2，13-14］。

人體外周血中存在著不同片段大小的cfDNA，cfDNA不僅是檢測(cè)人體內(nèi)腫瘤、胎兒發(fā)育情況和自身免疫缺陷疾病等重要的生物分子目標(biāo)，更能夠提供供體基因組的相關(guān)信息，對(duì)于疾病的檢測(cè)分析有著重要意義［15-18］。之前研究發(fā)現(xiàn)，孕婦血漿中來源于胎兒的cfDNA、腫瘤患者血漿中與腫瘤相關(guān)的cfDNA和自身免疫缺陷患者的cfDNA與健康人血漿中的cfDNA在片段大小上均有所差異。健康人血漿中cfDNA主峰的平均長度為l66 bp，而經(jīng)序列比對(duì)，來源于胎兒的cfDNA、與腫瘤相關(guān)的cfDNA和自身免疫缺陷疾病患者的cfDNA表現(xiàn)為在166 bp左右的主峰降低，而150 bp以下的DNA片段比例有所增加［19-20］。造成這種片段長度差異的原因很可能是該類cfDNA甲基化水平較低，相較于來自造血組織等高甲基化的cfDNA更容易被核酸酶水解［21］。

基于所要研究的目標(biāo)cfDNA（如胎兒的cfDNA、腫瘤相關(guān)的cfDNA和免疫缺陷患者體內(nèi)的cfDNA）與正常的cfDNA在片段長度上的差異，原則上可以通過這種片段長度的差異對(duì)目標(biāo)cfDNA進(jìn)行富集。常規(guī)的富集方法主要為電泳法［22］和色譜法［23］，但這兩種方法在成本、效率、敏感性和特異性方面均有一定的局限性，且由于操作繁瑣、結(jié)果一致性差（依賴于操作者的判斷）以及難以實(shí)現(xiàn)高通量運(yùn)行而難以應(yīng)用于臨床。

本研究通過發(fā)展一種基于新型磁性納米微粒的DNA片段篩選技術(shù)，利用磁分離法從樣本根源上實(shí)現(xiàn)了短片段DNA的富集（操作流程如圖1），與傳統(tǒng)的電泳和色譜分離技術(shù)相比，這一技術(shù)成本低，耗時(shí)短，操作簡單且回收效率高，未來更有可能實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化。篩選效果經(jīng)由臨床樣本驗(yàn)證，通過分離富集150 bp以下短片段DNA，這一技術(shù)能夠在孕婦血漿樣本中，相較于母體的cfDNA，更多地富集胎兒的cfDNA。富集后的胎兒cfDNA可用于進(jìn)一步測(cè)序分析，經(jīng)過富集處理，大大減少了母體背景DNA的干擾，這一進(jìn)步改善了現(xiàn)有方法因胎兒cfDNA比例過低而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，能夠提高無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的靈敏度和特異性。

圖1 富集短片段DNA的流程圖Fig. 1 Workflow of short DNA fragments enrichment

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清購自 Invintrogen（Gibco（26140-079）），孕婦血漿樣本來源于中國科學(xué)院大學(xué)附屬深圳醫(yī)院兒科的10名孕婦（未知胎兒性別）以及深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院的14名孕婦（已確定胎兒男性），所有實(shí)驗(yàn)均按照《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》進(jìn)行，并經(jīng)南方科技大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究的受試者均獲得知情同意。糖原（glycogen）購自VETEC（900925-5G），異丙醇購自MACKLIN麥克林（E809056-500 mL），聚乙二醇（PEG）、無水乙醇、TE buffer（pH9.0）均購自上海滬試。引物及探針設(shè)計(jì)選擇X、Y染色體特異性相關(guān)片段［24］，所用引物及探針均由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 羧基磁珠和羥基磁珠制備 磁珠制備及表面修飾參考文獻(xiàn)［25-26］。

1.2.2 DNA片段篩選 長片段DNA分離：首先取10 μL 從血漿中提取的 cfDNA，與 16 μL（1.6 × 條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=1.6∶1）羧基磁珠（分散于PEG）混合于1.5 mL離心管，用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 mL離心管中；短片段DNA回收：于上清液中加入4 μL糖原和8 μL羥基磁珠（分散于TE buffer），用渦旋振蕩器混勻后加入46.4 μL異丙醇，然后在渦旋振蕩器上渦旋10 min，孵育結(jié)束后離心5 s，然后將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清后，棄去上清液，對(duì)上述步驟所得到的羧基磁珠和羥基磁珠分別進(jìn)行兩次洗滌，每次使用1 mL 80%乙醇，渦旋30 s后離心5 s，置于磁力架上靜置2 min后棄上清液，兩次洗滌后將磁珠靜置晾干3 min后洗脫；產(chǎn)物洗脫：分別向裝有羥基磁珠和羧基磁珠的離心管中加入10 μL洗脫液（TE bufffer，pH 9.0），渦旋5 min后離心5 s，在磁力架上靜置3 min后，分別取上清到新的1.5 mL離心管，并置于-20℃冰箱保存（短期保存可置于4℃冰箱）。根據(jù)樣本體積、篩選片段閾值不同，體系內(nèi)各組分可等比例擴(kuò)大。所得產(chǎn)物用2100分析儀（安捷倫）進(jìn)行DNA片段分布分析。

1.2.3 二次DNA片段篩選（優(yōu)化后） 第一步長片段DNA分離：首先取10 μL從血漿中提取的cfDNA，與10 μL（1.0×條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=1∶1）羧基磁珠（分散于PEG）混合于1.5 mL離心管，用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 mL離心管中；第二步長片段DNA分離：于上清液中加入2 μL（0.2×條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=0.2∶1）羧基磁珠（分散于PEG），用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進(jìn)行孵育，孵育結(jié)束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 mL離心管中；短片段DNA回收：于上清液中加入4 μL糖原和8 μL羥基磁珠（分散于TE buffer），用渦旋振蕩器混勻后加入41.6 μL異丙醇，然后在渦旋振蕩器上渦旋10 min，孵育結(jié)束后離心5 s，然后將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清后，棄去上清液。對(duì)上述步驟所得到的羧基磁珠和羥基磁珠分別進(jìn)行兩次洗滌，每次使用1 mL 80%乙醇，渦旋30 s后離心5 s，置于磁力架上靜置2 min后棄上清液，兩次洗滌后將磁珠靜置晾干3 min后洗脫；洗脫：分別向裝有羥基磁珠和兩步羧基磁珠的離心管中加入 10 μL洗脫液（TE bufffer，pH 9.0），渦旋 5 min后離心5 s，在磁力架上靜置3 min后，分別取上清到新的1.5 mL離心管，并置于-20℃冰箱保存（短期保存可置于4℃冰箱）。根據(jù)樣本體積、篩選片段閾值不同，體系內(nèi)各組分可等比例擴(kuò)大。所得產(chǎn)物用2100分析儀（安捷倫）進(jìn)行DNA片段分布分析。

1.2.4 臨床樣本的富集驗(yàn)證 胎兒性別驗(yàn)證：將得到的孕婦血液樣本進(jìn)行血漿分離，然后提取血漿樣本中的cfDNA。當(dāng)孕婦所懷胎兒為男性時(shí)，血漿所提取cfDNA中的Y染色體相關(guān)片段則均來源于胎兒。由于各條染色體在cfDNA中所占比例相對(duì)穩(wěn)定，因此可以通過樣本中Y染色體的比例來估算胎兒cfDNA與母體cfDNA的比例。胎兒性別的確定是基于對(duì)母體血漿中提取的cfDNA進(jìn)行Y染色體相關(guān)片段的實(shí)時(shí)qPCR（TaqMan）測(cè)定。qPCR反應(yīng)混合物（總體積 10 μL），其中包含 5 μL TaqManTMFast Advanced Master Mix（Thermo Fisher）、Y 染色體正向和反向引物（各 0.5 μL 引物序列見表 1）、0.5 μL TaqMan-MGB探針（VIC熒光染料，10 μmol/L，序列 見 表 1）、1 μL DNA 樣 本 和 2.5 μL 不 含 RNase /DNase的水。在StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃ 10 min；60℃1 min 然后95℃ 15 s 循環(huán)39次；60℃ 2 min，循環(huán)結(jié)束后于10℃保存，所有步驟的升溫速率均為2℃/s，Ct值＜ 38的樣本被認(rèn)定為男性胎兒。

表1 引物和探針信息表Table 1 Information of primers and probes

1.2.5 胎兒cfDNA富集 對(duì)后續(xù)認(rèn)定為男性胎兒的21個(gè)樣本進(jìn)行DNA片段篩選，長短片段篩選閾值設(shè)定為150 bp，篩選方法如1.2.2，富集前后樣本使用數(shù)字PCR（ddPCR）進(jìn)行胎兒cfDNA與母體cfDNA比例的分析。

1.2.6 胎兒cfDNA比例變化測(cè)定 ddPCR反應(yīng)混合物總體積為14.5 μL，其中包含7.25 μL QuantStudioTM3D數(shù)字PCR預(yù)混液（Thermo Fisher Scientific），X染色體和Y染色體相關(guān)片段正向、反向引物和對(duì)應(yīng)探針（引物及探針序列見表1，X染色體相關(guān)片段熒光標(biāo)記為FAM，Y染色體相關(guān)片段熒光標(biāo)記為VIC）各為 0.725 μL（10 μmol/L），1.45 μL DNA 樣本和3.625 μL不含RNase/DNase的水。使用ProFlexTM2× Flat PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行ddPCR。熱循環(huán)條件如下：96℃ 10 min；60℃ 1 min然后98℃ 30 s 循環(huán)39次；60℃ 2 min，循環(huán)結(jié)束后于10℃保存，所有步驟的升溫速率均為2℃/s。循環(huán)結(jié)束后，使用QuantStudioTM3D Analysis SuiteTM軟件分析孔中所擴(kuò)增得到的熒光信號(hào)。胎兒cfDNA比例以ChrY%）計(jì)算：ChrY%= Chr Y的拷貝數(shù)/（Chr X的拷貝數(shù)+ Chr Y的拷貝數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 利用新型磁分離技術(shù)的DNA片段篩選結(jié)果

首先使用胎牛血清所提取的cfDNA進(jìn)行模型體系驗(yàn)證。所得產(chǎn)物經(jīng)2100分析儀High sensitive DNA模式進(jìn)行分析，從圖2-A上可以看出，相較于富集前，經(jīng)過富集后的cfDNA主峰左移并且峰值下降，富集后的cfDNA不含有長片段DNA。從圖2-B的定量數(shù)據(jù)分析來看，150 bp以下的DNA片段在富集前后從7.1%增加到36.4%，主峰的平均片段大小從174 bp下降為151 bp，這表明這一方法能夠顯著提高樣本中150 bp以下cfDNA的比例。

圖2 cfDNA短片段富集的模型體系驗(yàn)證Fig.2 Verification of short DNA fragments enrichment

2.2 臨床樣本的富集驗(yàn)證結(jié)果

ddPCR對(duì)X、Y染色體的拷貝數(shù)檢測(cè)流程見圖3-A。其中只檢測(cè)到X染色體相關(guān)片段擴(kuò)增的孔用藍(lán)色點(diǎn)表示，只檢測(cè)到Y(jié)染色體相關(guān)片段擴(kuò)增的孔用紅色點(diǎn)表示，同時(shí)檢測(cè)到X染色體和Y染色體相關(guān)片段擴(kuò)增的孔用綠色點(diǎn)表示，而未檢測(cè)到擴(kuò)增的孔用黃色點(diǎn)表示（圖3-B）。圖中二維ddPCR熒光幅值圖顯示富集前后樣本中X染色體和Y染色體相關(guān)片段的大致變化，在富集后X染色體的陽性孔數(shù)明顯減少，而Y染色體的陽性孔數(shù)幾乎保持不變，這證明了富集后Y染色體比例的增加（圖3-B）。后續(xù)對(duì)21個(gè)樣本的ddPCR結(jié)果進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在富集前后各個(gè)樣本的Y染色體比例都有顯著提高，富集后Y染色體比例提高大約為富集前的3.2倍（圖3-C和D）。

圖3 ddPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Enrichment efficiency evaluation by ddPCR

3 討論

調(diào)研已有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的高分辨率的對(duì)DNA片段篩選和分離的方法操作繁瑣且通量低，目前市面上還未有操作簡單、可重復(fù)性高、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的DNA片段高分辨率篩選方法，尤其是針對(duì)200 bp以下短片段DNA的篩選。本文所介紹的這種基于新型磁分離技術(shù)的DNA片段篩選克服了已有方法的弊端，并且可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量的篩選，未來在臨床應(yīng)用上具有極大的潛力。

首先以胎牛血清中提取的cfDNA作為模型體系，從理論上證明了這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)200 bp以下cfDNA片段高分辨率篩選的可行性。圖2中的數(shù)據(jù)證明，富集后的cfDNA能夠完全去除200 bp以上的長片段DNA，且富集后150 bp以下短片段DNA的占比增加近5倍，證明了這一技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)150 bp以下短片段DNA的富集，這對(duì)于未來應(yīng)用于臨床十分重要。之后通過對(duì)臨床孕婦血漿樣本中的cfDNA進(jìn)行富集，并利用ddPCR的分析方法，我們證明了這一技術(shù)能夠顯著提高孕婦血漿樣本中胎兒cfDNA（基于樣本中來源于男性胎兒Y染色體相關(guān)片段比例的變化）的比例，初步探索了這一技術(shù)在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域應(yīng)用的前景（圖3）。

基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在羧基磁珠與樣本體積比為1.6∶1時(shí)，雖能夠很好的富集150 bp以下短片段的DNA，但如圖2-A所示，富集后的cfDNA主峰大幅降低，在去除長片段DNA背景干擾的同時(shí)，也可能導(dǎo)致臨床樣本中目標(biāo)DNA的損失，從而導(dǎo)致關(guān)鍵信息的缺失進(jìn)而引起檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，這對(duì)于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中單基因遺傳病的篩查［27-29］、液體活檢早期篩查［30-31］和免疫缺陷疾病的診斷［10］均十分重要，尤其在腫瘤的早期檢測(cè)中，由于ctDNA（circlating tumor DNA）含量極低（僅為cfDNA的0.1‰-1‰）［30，32］，過多 150 bp 以下 cfDNA 的損失很可能造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。為了平衡短片段DNA的回收率和富集效率，我們將上述篩選方案進(jìn)行了優(yōu)化，在一步篩選的基礎(chǔ)上降低羧基磁珠的用量，并調(diào)整為兩次篩選（圖4）。

圖4 優(yōu)化后富集短片段DNA的流程圖Fig.4 Optimized workflow of short DNA fragments enrichment

二次篩選方法將羧基磁珠與樣本體積比從1.6∶1調(diào)整為第一步1∶1篩選（如圖4中第一步長片段DNA分離），第二步0.2∶1篩選（如圖4中第二步長片段DNA分離），通過降低羧基磁珠的用量來減少短片段DNA的損失，并將原本的一次篩選去除長片段DNA優(yōu)化為二次篩選，進(jìn)而提高短片段DNA的富集效率。具體步驟見1.2.3。結(jié)果如圖5，圖5-B中兩步長片段DNA分離結(jié)果表明，優(yōu)化后的兩次篩選起峰位置均在150 bp左右，即最大程度上保留了150 bp以下的cfDNA。圖5-C和5-D中150 bp以下DNA片段占比富集前后提高近4倍，主峰的平均長度從177 bp降至161 bp，優(yōu)化后的富集方法盡可能地減少了150 bp以下cfDNA的損失，并顯著提高了短片段cfDNA的比例，這對(duì)于未來將其應(yīng)用于腫瘤的早期篩查、免疫缺陷型疾病的診斷以及無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中單基因遺傳病的篩查具有重要意義。

圖5 優(yōu)化后胎牛血清cfDNA短片段的富集Fig. 5 Enrichment of short cfDNA fragments with fetal bovine serum by optimized workflow

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，優(yōu)化后的二次篩選能夠有效減少150 bp以下DNA片段的損失，這對(duì)于未來臨床上癌癥的早期篩查和自身免疫缺陷疾病的診斷具有很大的應(yīng)用潛力。已知在腫瘤患者血漿中ctDNA的含量非常低［33］；同樣在自身免疫缺陷疾病，如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中發(fā)現(xiàn)存在更多150 bp以下的cfDNA［34］，但大量的長片段cfDNA作為背景極大地干擾了相關(guān)靶標(biāo)DNA的信號(hào)；而當(dāng)前的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷只能實(shí)現(xiàn)胎兒染色體異常的檢測(cè)，還未能實(shí)現(xiàn)單基因遺傳病等的早期篩查［35］，均是由于目標(biāo)DNA豐度太低，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度受限于背景信號(hào)的干擾。在這些臨床應(yīng)用領(lǐng)域中，由于靶標(biāo)DNA均存在片段偏小（＜150 bp），且含量極低的問題，因此可以利用二次篩選技術(shù)從樣本根源上富集150 bp以下的DNA，并盡可能減少短片段DNA的損失。經(jīng)二次篩選后，基于新型磁分離技術(shù)的DNA片段篩選技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)最大程度地減少目標(biāo)長度DNA片段的損失，并顯著地提高150 bp以下DNA片段在樣本中的占比，保證了臨床信息的完整性。且操作簡單，一致性好，可自動(dòng)化程度高，未來更可結(jié)合自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

與其他同類技術(shù)以及傳統(tǒng)的色譜法和電泳法核酸分離技術(shù)相比，這一技術(shù)操作簡單，耗時(shí)短，且可自動(dòng)化程度高。在基于SPRI的DNA片段篩選技術(shù)中實(shí)現(xiàn)了技術(shù)突破，已經(jīng)達(dá)到了10-20 bp的分辨率差別，其篩選分辨率還有進(jìn)一步提高的空間。當(dāng)前這一技術(shù)僅應(yīng)用于小體積樣本的DNA片段篩選，未來通過磁珠的磁分離屬性，可應(yīng)用于高通量的自動(dòng)化篩選，相應(yīng)的技術(shù)路線還需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和調(diào)整。未來將這項(xiàng)高分辨率的DNA片段篩選技術(shù)與測(cè)序等技術(shù)相結(jié)合，有希望解決無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、液體活檢和免疫缺陷型疾病早篩中樣本信噪比低、靈敏度差的問題，對(duì)于如測(cè)序建庫前的DNA片段篩選也具有應(yīng)用潛力，運(yùn)用磁分離技術(shù)對(duì)提高測(cè)序建庫效率和節(jié)省成本有一定的推動(dòng)作用，使基于測(cè)序的疾病早篩進(jìn)入更深層次的領(lǐng)域，更有助于提高公眾健康水平。

4 結(jié)論

本研究基于一種新型的磁分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高分辨率的短片段DNA的富集。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及優(yōu)化證明，這一技術(shù)能夠盡可能降低150 bp以下短片段DNA的損失，并能夠顯著提高樣本中150 bp以下短片段DNA的比例。這項(xiàng)技術(shù)在未來有可能更多地應(yīng)用于包括測(cè)序建庫、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、液體活檢、免疫缺陷型疾病早篩等方向。

致謝

感謝中國科學(xué)院大學(xué)附屬深圳醫(yī)院及深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院所提供的孕婦血漿樣本。