李恬靜薇 鄒瀟瀟 朱軍 鮑時(shí)翔

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，秦皇島 066000；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）是一種能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析的方法，通過(guò)在反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行分析。RT-qPCR具有靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單便捷等優(yōu)點(diǎn)［1-2］。RT-qPCR被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究中，然而RT-qPCR的準(zhǔn)確性受到許多因素的影響，包括RNA樣本質(zhì)量和提取方法的差異，以及反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率［3-5］，所得的結(jié)果需要進(jìn)行校準(zhǔn)后才具有生物學(xué)意義。

最常用的RT-qPCR校準(zhǔn)方法是使用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因。內(nèi)參基因作為參照的基因在各組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在研究基因的表達(dá)水平中常被用作數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)，以消除RT-qPCR不同樣品的差距和RT-qPCR操作中的誤差。最普遍使用的內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)源性參照基因，也叫看家基因（持家基因），在生物體各細(xì)胞組織中都能表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物是維持細(xì)胞生命活動(dòng)必須的蛋白質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白（Actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、微管蛋白基因（Tubulin）和核糖體蛋白（18S）等。但近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，這些常用內(nèi)參基因在不同的物種，不同的組織細(xì)胞，不同的發(fā)育階段和實(shí)驗(yàn)條件都存在較大的表達(dá)差異［6-7］。在擬南芥和雜交白楊不同組織中發(fā)現(xiàn)幾種常用內(nèi)參基因（TUB、Actin、UBQ和EF1a）的表達(dá)大多不穩(wěn)定，如果使用不適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會(huì)直接影響RT-qPCR的結(jié)果準(zhǔn)確性［8］。因此，在將內(nèi)參基因用于RT-qPCR校準(zhǔn)之前，需要對(duì)每個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估。目前，已經(jīng)開發(fā)出了幾種用于內(nèi)參基因篩選的軟件如geNorm［9］、NormFinder［10］和 BestKeeper［11］等，可以在給定的實(shí)驗(yàn)條件下從一組候選基因中篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

目前，已經(jīng)有關(guān)于一些物種內(nèi)參基因的篩選的報(bào)道，如百合［12］、芹菜［13］、石蒜［14］、西瓜［15］、馬鈴薯［6］、龍眼［16］等。類似的內(nèi)參基因的篩選在藻類中也有相關(guān)報(bào)道，如條斑紫菜［17］、壇紫菜［18］、赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）［19］、紅色赤潮藻（Akashiwo sanguinea）［20］等。然而目前還沒有用于蕨藻RT-qPCR分析的內(nèi)參基因篩選的報(bào)道。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隸屬于綠藻門（Chlorophyta）蕨藻屬（Caulerpa），俗稱“海葡萄”，是一種單細(xì)胞多核生物，但根據(jù)其形態(tài)學(xué)差異，可以分為3個(gè)部分，直立枝，匍匐莖和假根。海葡萄作為一種在熱帶地區(qū)廣泛分布的大型經(jīng)濟(jì)綠藻，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。首先其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種人體必需的氨基酸、維生素［21］、礦質(zhì)元素和不飽和脂肪酸［22］，且脂肪含量低，是潛在的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值保健食品，在日本和東南亞都被視為高級(jí)食材。同時(shí)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻還可以改善海洋環(huán)境，為海洋動(dòng)物提供餌料以及良好的棲息環(huán)境對(duì)提高生物多樣性和維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)具有重大意義［23］。目前在中國(guó)的東南沿海城市已經(jīng)開始了大規(guī)模的海葡萄養(yǎng)殖，但產(chǎn)量和品質(zhì)參差不齊，其中不適宜鹽度、溫度、光照都會(huì)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響［24］。為了更深入的分析長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的抗逆分子機(jī)制，可以使用RT-qPCR來(lái)分析其在脅迫條件下的基因表達(dá)情況。選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Φ贸鰷?zhǔn)確可靠的RT-qPCR分析結(jié)果至關(guān)重要。

本研究使用RT-qPCR對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻5個(gè)候選內(nèi)參基因：ClACT（肌動(dòng)蛋白），ClGAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶），ClTUB（β微管蛋白），Cl18S（18S核糖體RNA）和ClEF1a（延伸因子1-alpha）在不同部位（匍匐莖和直立枝）和不同脅迫處理?xiàng)l件下表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并使用比較Ct值法，BestKeeper，geNorm和NormFinder軟件對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析和比較。此外分別使用分析得出的最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因來(lái)對(duì)熱激蛋白90（ClHSP90）和甾體傳感結(jié)構(gòu)域（ClSSD）的表達(dá)水平（已經(jīng)明確這兩個(gè)基因在脅迫條件下的表達(dá)情況）［25］進(jìn)行校準(zhǔn)來(lái)驗(yàn)證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。為分析長(zhǎng)莖葡萄蕨藻甚至蕨藻在脅迫條件下抗逆機(jī)制提供了重要理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品全部來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室在海南省昌江長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖基地。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好、藻體健壯的樣品，使用無(wú)菌海水清洗幾次后在光照培養(yǎng)箱中溫度27℃，光照40 μmol/（s · m2）， 鹽 度 30 ‰， 晝 夜 光 周 期 為12L∶12D暫養(yǎng)一周，然后進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 在潔凈的1 L燒杯中分別加入800 mL無(wú)菌海水，向其中投放適量潔凈藻體，分別置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理方法如表1所示，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理4 h后，分別取其匍匐莖和直立枝用紙吸干表面水分，迅速放于液氮中，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存。

表1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品處理方法Table 1 Sample processing method of C. lentillifera

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 稱取400-500 mg冷凍樣品，放入液氮中充分研磨，使用OMEGA 公 司 的 E.Z.N.A.Plant RNA Kit（R6827-01）提取各個(gè)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品的總RNA，提取過(guò)程中使 用 OMEGA RNase-Free DNaseⅠ Set（E1091-01）處理消除基因組DNA污染。使用微量分光光度計(jì)（Nanodrop） 測(cè)量RNA 濃 度（ng/μL）、A260/280和A260/230。同時(shí)使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，來(lái)判斷所提取的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品總RNA的總量和純度。隨后，使用Thermo公司的RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit（K1622），以所提取的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品總RNA為模板（2 μg）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用已知基因引物進(jìn)行PCR，再對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，放置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.3 候選內(nèi)參基因的篩選與引物設(shè)計(jì) 以NCBI中已有的內(nèi)參基因序列（如Actin、GAPDH、EF1a、TUB、18S等）為參考，利用本地BLAST搜索長(zhǎng)莖葡萄蕨藻基因組（本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)）的同源序列，從比對(duì)結(jié)果中篩選出每個(gè)基因得分最高且E-value最低的序列，作為各內(nèi)參基因的參考序列，分別命名為ClACT、Cl18S、ClGAPDH、ClEF1a和ClTUB。利用 PrimerPremier 5 軟件設(shè)計(jì)基因特異引物，克隆驗(yàn)證各內(nèi)參基因的序列后，再以驗(yàn)證無(wú)誤的序列為模板，設(shè)計(jì)RT-qPCR引物。以cDNA為模板，通過(guò)檢測(cè)普通PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物和分析產(chǎn)物的溶解曲線，檢測(cè)各引物的特異性。經(jīng)初步分析，5個(gè)候選內(nèi)參基因（表2）滿足RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)要求，故用作后續(xù)研究。

表2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻5個(gè)候選內(nèi)參基因的RT-qPCR引物Table 2 RT-qPCR primers for five candidate internal reference genes of C. lentillifera

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及基因的擴(kuò)增效率 通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定每對(duì)引物的擴(kuò)增效率。將對(duì)照組樣品的cDNA進(jìn)行稀釋（ClACT、ClGAPDH、ClEF1a、ClTUB進(jìn)行5倍濃度稀釋，Cl18S由于與其他基因相比表達(dá)豐度較高所以進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋），各組樣品均稀釋5個(gè)濃度梯度。以不同稀釋倍數(shù)的樣品cDNA為模板，分別進(jìn)行RT-qPCR，以Ct值為Y軸，起始模板濃度為X軸（log5，Cl18S為log10）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算引物擴(kuò)增效率。計(jì)算公式如下：

1.2.5 候選內(nèi)參基因RT-qPCR分析 分別以不同樣品cDNA為模板，利用5對(duì)候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用TranStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141）配制RT-qPCR反應(yīng)體系，每對(duì)引物的每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

每個(gè)反應(yīng)體系中含有2 μL的稀釋cDNA模板和10 μL 的 2×TranStart Tip Green qPCR SuperMix， 上游和下游引物各1 μL，6 μL的無(wú)菌水，最終體積為20 μL。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；然后從55℃緩慢升溫至95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)RT-qPCR的數(shù)據(jù)結(jié)果，使用EXCEL 2016和Origin 9.1比較各個(gè)樣品的Ct值并繪制Ct值分布箱型圖，再分別使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 三個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件進(jìn)行5個(gè)基因片段在脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定性的分析。

1.2.7 內(nèi)參基因可靠性驗(yàn)證 根據(jù)篩選結(jié)果，選擇篩選出來(lái)的最優(yōu)和最差的內(nèi)參基因做為標(biāo)準(zhǔn)化因子，分別對(duì)不同環(huán)境脅迫下（光照脅迫360 μmol/（s·m2）；溫 度 脅 迫 37℃ ；鹽 度 脅 迫40‰）熱激蛋白90（ClHSP90）和甾體傳感結(jié)構(gòu)域（ClSSD）基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。表3為ClHSP90和ClSSD引物序列。

表3 ClHSP90 和 ClSSD 引物序列Table 3 Primer sequences of ClHSP90 and ClSSD

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

將提取出的總RNA樣品使用微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：各樣品的總RNA濃度較高，峰圖優(yōu)良，A260/280在2.0左右，A260/230大于2.0。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），結(jié)果顯示：所提取的總RNA的28S和18S條帶清晰明亮，沒有其他雜帶。以上結(jié)果均說(shuō)明所提取的RNA的濃度和純度較高，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from C. lentillifera

2.2 候選內(nèi)參基因的引物特異性和PCR效率

使用對(duì)照組的cDNA為模板對(duì)所設(shè)計(jì)的候選內(nèi)參基因和用于驗(yàn)證的差異表達(dá)基因引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，條帶單一，明亮，沒有雜帶和引物二聚體現(xiàn)象。使用不同的樣品對(duì)各個(gè)候選內(nèi)參基因和用于驗(yàn)證的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR，將得到的熔解曲線匯總（圖2），結(jié)果顯示每個(gè)基因各個(gè)樣品的溶解曲線峰值重合率較高，且只有單一的峰，在達(dá)到Tm值之前沒有雜峰出現(xiàn)。進(jìn)一步測(cè)序分析表明，所有測(cè)序擴(kuò)增片段均與引物設(shè)計(jì)所用序列相匹配。各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性R2均大于99%，擴(kuò)增效率均在90%-105%之間（表2）。

圖2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻5個(gè)候選內(nèi)參基因和2個(gè)差異表達(dá)基因熔解曲線Fig. 2 Melting curve of 5 candidate internal parameters and two differential expression genes of C. lentillifera

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

如表4、5所示，本研究使用比較Ct值法、BestKeeper、geNorm、NormFinder軟件分析了5個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，包括不同實(shí)驗(yàn)條件（溫度脅迫、鹽度脅迫和光照脅迫）以及不同組織部位（匍匐莖和直立枝）。BestKeeper可以計(jì)算出每個(gè)基因產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，相關(guān)系數(shù)越大，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。NormFinder和geNorm程序都能最終獲得各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，表達(dá)穩(wěn)定值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。

表4 5個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性BestKeeper、geNorm和NormFinder分析結(jié)果Table 4 Analysis results of the stability of five candidate reference genes by BestKeeper, geNorm and NormFinder

使用LightCycler?96軟件分析候選內(nèi)參基因的Ct表達(dá)譜（圖3）。Ct（閾值周期）值是擴(kuò)增曲線和閾值線之間的交點(diǎn)，它是RT-qPCR反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對(duì)量度。在本研究中，所有數(shù)據(jù)中候選內(nèi)參基因的Ct值在7.28-27.30之間。在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中，Cl18S的轉(zhuǎn)錄豐度最高（Cl18S在所有樣品中的Ct值的算術(shù)平均值最小，為8.30，圖3-F）；ClTUB在所有樣本子集中的表達(dá)量均較低（ClTUB在所有樣品中的Ct值的算術(shù)平均值最大，為24.94，圖3-F）。Cl18S和ClACT基因的Ct值分布相對(duì)集中（7.28-10.99和19.53-23.53），因此Cl18S和ClACT的基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。ClEF1a值的Ct分布較分散（19.92-26.22），因此與其他基因相比，ClEF1a的基因表達(dá)最不穩(wěn)定。

圖3 候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)譜Fig. 3 Expression profile of candidate internal reference genes in samples

通過(guò)計(jì)算每個(gè)候選內(nèi)參基因4種分析結(jié)果（Ct值分布標(biāo)準(zhǔn)差，BestKeeper SD值，geNorm M值和NormFinder表達(dá)穩(wěn)定值）的幾何平均值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了整合，并對(duì)其進(jìn)行了綜合排序（表5）。當(dāng)考慮所有樣品時(shí)，ClACT的穩(wěn)定性最好（SD=0.67，M=0.685，NormFinder穩(wěn)定值=0.175）其次為Cl18S（SD=0.68，M=0.765，NormFinder穩(wěn) 定 值 =0.352）。ClTUB穩(wěn)定性最差（SD=0.86，M=1.077，NormFinder穩(wěn)定值=0.706）。在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的匍匐莖和直立枝中ClACT和Cl18S的穩(wěn)定性都很高，ClTUB穩(wěn)定性都較差，ClGAPDH在匍匐莖中表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。在光照脅迫條件下，ClGAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，ClTUB的穩(wěn)定性較差。在鹽度脅迫下ClACT和ClGAPDH則表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，ClEF1a的穩(wěn)定性最差。在溫度脅迫條件下ClGAPDH和Cl18S的穩(wěn)定性較好，ClTUB的穩(wěn)定性最差。綜合以上結(jié)果，ClACT在大多樣品中表達(dá)穩(wěn)定性都較好，但會(huì)受到光照脅迫的影響，ClGAPDH在光照脅迫條件下穩(wěn)定性最好，但在其他處理樣本中穩(wěn)定性存在差異。

表5 5個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序Table 5 Stability rankings of five candidate reference genes

使用geNorm來(lái)確定來(lái)內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。該軟件可以分析引入一個(gè)新內(nèi)參基因?qū)?biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異系數(shù)（Vn/Vn+1）的影響，并根據(jù)Vn/Vn+1來(lái)確定在特定實(shí)驗(yàn)條件下最適內(nèi)參基因數(shù)目。在我們的研究中，光照脅迫處理組的所有V值低均于0.15，其他處理組V值大多在0.15-0.25之間，多數(shù)實(shí)驗(yàn)組的V2/3值在0.15-2.00之間（圖4）。

圖4 geNorm軟件確定最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig. 4 Number of the most suitable reference genes determined by geNorm software

2.4 篩選出的內(nèi)參基因的驗(yàn)證

綜合4種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ClACT，ClGAPDH和Cl18S在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，但由于Cl18S在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中的表達(dá)豐度與其他基因差異較大，不適宜作為內(nèi)參基因使用。ClTUB在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中大多處理樣本中表達(dá)穩(wěn)定性都較差。所以分別使用ClACT、ClGAPDH和ClTUB作為校準(zhǔn)內(nèi)參基因分析ClHSP90和ClSSD相對(duì)表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證所篩選出的內(nèi)參基因的可靠性。結(jié)果表明，兩個(gè)基因（ClHSP90和ClSSD）的表達(dá)水平在脅迫環(huán)境下均上調(diào)，并且當(dāng)使用ClACT或ClGAPDH作為內(nèi)參基因時(shí)，觀察到相似的變化模式。但是，使用ClTUB（最不穩(wěn)定）進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí)，可以明顯的觀察到HSP90和SSD在光照脅迫下的表達(dá)水平被高估（圖5），與實(shí)際情況不符。顯然是由于樣品中ClTUB表達(dá)的穩(wěn)定性低引起的，這表明在RT-qPCR分析中選擇合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

圖5 使用不同內(nèi)參基因分析HSP90（A）和SSD（B）在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Analysis of relative expressions of HSP90（A）and SSD（B）by different reference genes under the stress of C. lentillifera

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，已經(jīng)成為研究基因表達(dá)的重要方法之一。為了獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中的每一步都需要做好，包括RNA的質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)操作等，但除了這些，選擇合適的內(nèi)參基因也是必不可少的步驟。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該具備以下幾個(gè)條件：（1）同種生物的不同組織部位不同生長(zhǎng)階段都能穩(wěn)定表達(dá)［26］；（2）在各種環(huán)境下都能穩(wěn)定表達(dá)，不受各種生物和非生物脅迫影響［27］；（3）在實(shí)驗(yàn)材料中不存在假基因；（4）表達(dá)豐度與目標(biāo)基因相近［28］。

由于不同的分析方法的側(cè)重點(diǎn)不同，所以給出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序結(jié)果也不同。例如在擬南芥中Actin和EF1a基因在geNorm分析結(jié)果中為最穩(wěn)定的兩個(gè)基因，而這兩個(gè)基因在NormFinder分析結(jié)果中的排名卻相對(duì)靠后［29］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，ClGAPDH的穩(wěn)定性在不同的分析方法之間差異很大。因此，為了獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，最好使用不同的軟件進(jìn)行綜合分析。在某些物種中，相同內(nèi)參基因在不同組織部位中的穩(wěn)定性可能有所不同。EF1a基因在脅迫條件下的大葉龍膽葉片中表達(dá)較穩(wěn)定，但在根或不同發(fā)育階段的組織中表達(dá)不穩(wěn)定［30］。但在我們的研究中，通過(guò)比較長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不同部位的候選內(nèi)參基因的排序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其直立枝和匍匐莖各個(gè)基因的排列順序雖有差別，但篩選出的最佳內(nèi)參基因都為ClACT，而ClTUB基因的穩(wěn)定性都較差。這可能與長(zhǎng)莖葡萄蕨藻作為單細(xì)胞多核生物的形態(tài)特征有關(guān)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)光照脅迫條件下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序與其他樣品之間存在一定差異，這可能與長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在光照脅迫條件下的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制有關(guān)，但由于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)光照脅迫的調(diào)控機(jī)制尚未明確，具體原因還需要進(jìn)一步研究才能確認(rèn)。

Actin即肌動(dòng)蛋白基因，是細(xì)胞中的一種重要的骨架蛋白，并且同時(shí)在細(xì)胞移動(dòng)，細(xì)胞分泌，細(xì)胞吞噬等起到重要作用，在不同物種間表現(xiàn)出高度的保守性。在研究條斑紫菜葉狀體在不同環(huán)境脅迫下的基因表達(dá)情況時(shí)，可以選擇肌動(dòng)蛋白Actin作為內(nèi)參基因［31］。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中ClACT表達(dá)最穩(wěn)定，最適合作為研究脅迫條件下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況時(shí)的內(nèi)參基因。在使用RT-qPCR研究萊茵衣藻，獼猴桃和龍眼的基因表達(dá)情況時(shí)，也通常使用Actin作為內(nèi)參基因［32-34］。GAPDH即甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因，是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，廣泛分布于各種組織中的細(xì)胞，并且?guī)缀踉谒薪M織中都有較高水平的表達(dá)，同種生物的不同組織的表達(dá)水平也幾乎一致。已經(jīng)有研究證明GAPDH在衣藻中表達(dá)最穩(wěn)定，最適合作為內(nèi)參基因［35］。本研究中ClGAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性與其他候選基因相比處于較高水平，可以作為內(nèi)參基因。同時(shí)，在其他物種如李子［36］，枸杞［37］等中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。

研究中Cl18S在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中的表達(dá)豐度較高，與其他基因表達(dá)豐度差異很大，不適宜做為優(yōu)先考慮的內(nèi)參基因。在其他的物種的研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論，如18SrRNA在對(duì)龍眼［16］和馬鈴薯［6］等進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選時(shí)，18SrRNA也都顯示出較高的表達(dá)豐度。Tubulin在進(jìn)化中具有高度的保守性，所以常在RT-qPCR中被用做內(nèi)參基因。例如Tubulin在壇紫菜不同生長(zhǎng)階段表達(dá)穩(wěn)定，豐度適合，可作為內(nèi)參基因［18］。但本研究中ClTUB在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不同組織部位中、光照脅迫條件下和溫度脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性都相對(duì)較差，所以并不適合作為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的內(nèi)參基因。

geNorm軟件計(jì)算得出的V值可以用于確定最佳內(nèi)參基因數(shù)，通常將0.15用作臨界值，這意味著當(dāng)Vn/Vn+1小于0.15時(shí)，不需要額外增加內(nèi)參基因。但是，實(shí)際上0.15作為臨界值過(guò)于理想化，在大多數(shù)研究中都很難達(dá)到［9］，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行微調(diào)。基于此標(biāo)準(zhǔn)，建議使用兩個(gè)篩選出的最穩(wěn)定基因作為內(nèi)參基因來(lái)對(duì)脅迫條件下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況進(jìn)行校準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本研究分析和比較了5個(gè)候選內(nèi)參基因長(zhǎng)莖葡萄蕨藻不同脅迫條件和不同組織部位的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示使用兩個(gè)合適的內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)化，可在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻基因表達(dá)情況研究中獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。在所有測(cè)試的實(shí)驗(yàn)條件下，ClACT和ClGAPDH的組合都是最佳內(nèi)參基因組合，而ClTUB表達(dá)穩(wěn)定性較差不適合作為內(nèi)參基因。ClHSP90和ClSSD基因表達(dá)驗(yàn)證表明，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ谠赗T-qPCR中獲得準(zhǔn)確的結(jié)果至關(guān)重要。本研究為使用RT-qPCR分析脅迫條件下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻基因表達(dá)提供了理論支持。