王克朕，蘭春根，谷峰，馬勇杰

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院1.腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.乳腺病理科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

膠質(zhì)瘤是成年人中最常見，同時致死率最高的腦部腫瘤[1-2]。盡管現(xiàn)階段對膠質(zhì)瘤的認(rèn)識日漸加深，包括手術(shù)切除、放療和化療在內(nèi)的治療手段已取得長足進(jìn)步，但由于膠質(zhì)瘤的高侵襲性，治療效果仍不令人滿意[3-6]。進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過程中的關(guān)鍵分子對于實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者的精準(zhǔn)治療具有重要價(jià)值。多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1（PTBP1）是核不均一性核糖核蛋白（hnRNP）家族的成員，參與調(diào)控多種分子的轉(zhuǎn)錄后修飾[7-8]。研究表明，PTBP1在正常神經(jīng)發(fā)育過程中表達(dá)受到抑制，而在多種腦腫瘤中高表達(dá)[9-10]，但是其在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮的功能尚不明確。本研究利用多個數(shù)據(jù)庫分析PTBP1在膠質(zhì)瘤和癌旁組織中的表達(dá)水平及其與膠質(zhì)瘤的組織學(xué)級別和患者預(yù)后的關(guān)系；并通過慢病毒感染篩選出穩(wěn)定敲低PTBP1的LN229細(xì)胞株，進(jìn)而探究PTBP1蛋白對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229和人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293T（American Type Culture Collection），胎牛血清（GIBCO公司），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（GIBCO公司），Transwell小室（Corning公司），Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），聚凝胺（polybrene，Sigma公司），遺傳霉素（G418，Solarbio公司），EdU細(xì)胞增殖試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR引物（生工生物工程股份有限公司），膠回收試劑盒（TaKaRa公司），限制性內(nèi)切酶BamH1-HF和EcoR1-HF（NEB公司），質(zhì)粒小提試劑盒（天根生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen公司），MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Green（TaKaRa公司），PTBP1抗體（Santa Cruz公司），β-actin抗體（Santa Cruz公司）。

1.2 研究對象 下載并整理GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫中的正常腦組織樣本信息，選取資料完善的1 152例正常腦組織樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行分析。下載并整理TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中的膠質(zhì)瘤樣本信息，選取資料完善的603例膠質(zhì)瘤樣本（GradeⅡ：n=213，GradeⅢ：n=238，GradeⅣ：n=152）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行分析。下載并整理CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中的膠質(zhì)瘤樣本信息（數(shù)據(jù)集ID：mRNAseq_325），選取資料完善的309例膠質(zhì)瘤樣本（GradeⅡ：n=98，GradeⅢ：n=74，GradeⅣ：n=137）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行分析。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) LN229和HEK-293T細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，放置在含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.3.2 穩(wěn)定敲低PTBP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將引物（上游引物：5′-GATCCGCGTGAAGATCCTGTTCAATACTCGAGTATTGAACAGGATCTTCACGCTTTTTG-3′；下游引物：5′-AATTCAAAAAGCAAAGTGCAACGTATTGTTACTCGAGTATTGAACAGGATCTTCACGCG-3′）退火，用限制性內(nèi)切酶BamH1-HF和EcoR1-HF對質(zhì)?？蛰d體pLVX-scramble進(jìn)行雙酶切，直接與退火產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)宿主細(xì)菌，最終提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證，得到pLVX-shPTBP1重組質(zhì)粒。

1.3.3 慢病毒載體的包裝 在10 cm培養(yǎng)皿中提前鋪好HEK-293T細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁并長到80%~90%時，將目的質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒1和包裝質(zhì)粒2共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293T細(xì)胞，6~8 h換液，48 h收集上清于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清在-80℃保存。

1.3.4 細(xì)胞的感染 在3.5 cm培養(yǎng)皿中鋪入約30%~40%的LN229細(xì)胞，次日待細(xì)胞貼壁后移除培養(yǎng)液，重新加入1 mL新培養(yǎng)液和1 mL制備好的病毒液，以及2μL polybrene（10 mg/mL），5 h后更換培養(yǎng)液。慢病毒感染48 h后加入G418（2 g/L）進(jìn)行藥篩，藥篩1周后即可進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

1.3.5 Western印跡檢測 移除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS沖洗3次，將PBS移除干凈，加入裂解液于冰上裂解細(xì)胞蛋白，測定濃度并定量后進(jìn)行SDS-PAGE變性電泳（膠濃度：10%），然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（β-actin：蛋白上樣量：40μg，一抗稀釋比例：1∶5 000；PTBP1：蛋白上樣量：40μg，一抗稀釋比例：1∶1 000）4℃過夜孵育。孵育完成后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后避光加入二抗（稀釋比例：1∶8 000），室溫孵育50 min。孵育完成后用TBST洗膜4次，每次10 min。使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.3.6 RNA提取和RT-qPCR 使用Trizol試劑從LN229細(xì)胞中提取總RNA，并通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)得到cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green進(jìn)行RT-qPCR對PTBP1的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。以GAPDH的表達(dá)量作為對照。使用△△Ct法計(jì)算差異倍數(shù)。

1.3.7 EdU實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于12孔板，使其匯合度小于10%。移除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS沖洗3次，移除PBS，加入含有10%胎牛血清的新培養(yǎng)液，然后加入10μmol/L EdU，在含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育完成后移除培養(yǎng)液并用PBS沖洗3次，將PBS移除干凈后加入4%的多聚甲醛（PFA），室溫固定30 min。固定完成后移除4%的PFA并用PBS沖洗3次，然后加入DAPI（PBS稀釋，稀釋比例1：1 500）染色10 min。移除DAPI，用PBS沖洗3次后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照計(jì)數(shù)。

1.3.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室上室中加入200μL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸的5×104個細(xì)胞，下室加入500μL含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于含有5%CO2的37%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出，用棉簽小心擦拭掉上室細(xì)胞，然后將Transwell小室用4%的PFA溶液固定30 min，用吉姆薩染液染色45 min，用DDW清洗3次后封片并在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.3.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室上室中鋪入用無血清的DMEM培養(yǎng)基7：1稀釋的Matrigel基質(zhì)膠35μL，置于37℃凝膠1 h以上后取出，上室加入200μL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸的1×105個細(xì)胞，下室加入500μL含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于含有5%CO2的37%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽小心擦拭掉上室細(xì)胞，然后將Transwell小室用4%的PFA溶液固定30 min，用吉姆薩染液染色45 min，用DDW清洗3次后封片并在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，正態(tài)、方差齊資料組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier分析患者的預(yù)后情況，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTBP1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 數(shù)據(jù)顯示，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中PTBP1的mRNA水平升高（圖1）。PTBP1 mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)隨著組織學(xué)級別的升高而升高（GradeⅣ＞GradeⅢ＞GradeⅡ），即與組織學(xué)級別呈正相關(guān)（圖2）。

圖1 PTBP1在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)Fig 1 Theexpression of PTBP1 in glioma and normal brain tissues

圖2 PTBP1在不同WHO分級的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Fig 2 Theexpression of PTBP1 in different WHO gradesof glioma

2.2 PTBP1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 如圖3所示，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明PTBP1高表達(dá)患者擁有更短的總生存期（OS），預(yù)后更差，即PTBP1的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。

圖3 PTBP1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系Fig 3 Relationship between the expression of PTBP1 and the prognosisof glioma patients

2.3 穩(wěn)定敲低PTBP1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229用慢病毒感染后，獲得穩(wěn)定敲低目的蛋白的細(xì)胞株shPTBP1/LN229及對照scr/LN229。Western印跡和RT-qPCR結(jié)果顯示PTBP1蛋白和mRNA在LN229細(xì)胞中穩(wěn)定敲低（圖4），mRNA水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 LN229細(xì)胞系中PTBP1的表達(dá)情況Fig 4 Theexpression of PTBP1 in LN229 cell line

2.4 敲低PTBP1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果表明，shPTBP1/LN229的增殖能力弱于對照組細(xì)胞系（圖5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 Ed U實(shí)驗(yàn)檢測敲低PTBP1對LN229細(xì)胞增殖能力的影響Fig 5 Effect of PTBP1 knockdown on thecell proliferation ability of LN229 by EdUassay

2.5 敲低PTBP1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 結(jié)果表明，shPTBP1/LN229遷移的細(xì)胞數(shù)目少于對照組細(xì)胞系（圖6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。另外，shPTBP1/LN229侵襲的細(xì)胞數(shù)目也少于對照組細(xì)胞系（圖7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測敲低PTBP1對LN229細(xì)胞遷移能力的影響Fig 6 Effect of PTBP1 knockdown on thecell migration ability of LN229 by migration assay

圖7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測敲低PTBP1對LN229細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 7 Effect of PTBP1 knockdown on thecell invasion ability of LN229 by invasion assay

3 討論

膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)上皮的腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。年發(fā)病率為3人/10萬人～8人/10萬人。膠質(zhì)瘤一般呈侵襲性生長，總體療效不佳，尤其是具有高度間變的生長特性的高分級膠質(zhì)瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)快且預(yù)后差，是神經(jīng)外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一?，F(xiàn)階段，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)及基因組學(xué)的發(fā)展，人們對其發(fā)病機(jī)制有了更深的認(rèn)識，靶向治療、免疫治療等內(nèi)科綜合治療有望成為膠質(zhì)瘤極具潛力的治療方式。所以，深入探索膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過程中的關(guān)鍵分子對于提高膠質(zhì)瘤治療效果，實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者的精準(zhǔn)治療具有重要意義。

hnRNP家族包括一大類RNA結(jié)合蛋白，它們在核酸代謝的多個方面發(fā)揮作用，包括選擇性剪接、維持mRNA穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)。盡管在結(jié)構(gòu)域組成和功能上不盡相同，但是多種hnRNP都具有相似的特征[11]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，hnRNP蛋白在許多腫瘤中高表達(dá)。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞癌中可以監(jiān)測到hnRNP A2/B1單克隆抗體，大部分肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)hnRNP A2/B1，且在肺癌早期表達(dá)高于晚期，因此有學(xué)者推測它可以用作監(jiān)測肺癌早期發(fā)生的血清腫瘤標(biāo)志物[12]。此外，還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，hnRNP K、E1及E2可以促進(jìn)原癌基因c-myc mRNA的翻譯；hnRNPK也在腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散過程中起限速作用[13]。以上研究結(jié)果表明，hn－RNP家族作為腫瘤標(biāo)志物可能擁有良好的前景。

PTBP1作為hnRNP家族的一員，是一種已知的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控mRNA的剪接、翻譯、穩(wěn)定性和定位，具有多種與RNA代謝相關(guān)的分子功能[14-15]。在腫瘤細(xì)胞中，糖酵解是PTBP1參與的重要過程之一[16]。PTBP1促進(jìn)丙酮酸激酶（PK）M2亞型的表達(dá)，同時降低PKM1的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)變，最終影響腫瘤發(fā)生[17-18]。另外，PTBP1通過與自噬相關(guān)蛋白10（ATG10）的直接相互作用負(fù)反饋調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，在結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。敲降PTBP1能夠促進(jìn)細(xì)胞分化周期蛋白（CDC42）的抑癌亞型CDC42-v2的表達(dá)，進(jìn)而影響卵巢癌的惡性進(jìn)展[20]。此外，PTBP1通過調(diào)控可變剪接以及與多種分子相互作用，在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用。已有研究證實(shí)，PTBP1能夠通過其內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）樣元件調(diào)節(jié)RNA特異性腺苷脫氨酶1（ADAR1）p110的翻譯模式，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[21]。膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中長鏈非編碼RNA（lncRNA）PVT1和PTBP1表達(dá)增強(qiáng)，miR-128-1-5p表達(dá)降低。PVT1的下調(diào)或miR-128-1-5p的上調(diào)通過抑制PTBP1的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[22]。PTBP1的升高介導(dǎo)人膜聯(lián)蛋白A7（ANXA7）外顯子的可變剪接，削弱其腫瘤抑制功能并促進(jìn)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移[23]。另外，絲氨酸和精氨酸富含剪接因子3（SRSF3）通過與PTBP1及其同源蛋白多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白2（PTBP2）相互作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲[24]。

本研究利用多個數(shù)據(jù)庫以及生物信息學(xué)分析探究了PTBP1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并與膠質(zhì)瘤的組織學(xué)級別和膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。此外，本研究通過感染慢病毒的方法在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中敲低PTBP1，利用功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTBP1蛋白可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，PTBP1在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)及其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中發(fā)揮的促癌功能，提示PTBP1具有在膠質(zhì)瘤中作為生物標(biāo)志物和重要治療靶點(diǎn)的潛力，其在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮功能的具體分子機(jī)制具有重要研究價(jià)值。