易 柳，王瑞穎，高元峰，林麗美，歐陽榮

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410207）

烏藥葉為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregate(Sims)Kosterm的干燥葉，性辛、溫，歸脾、腎經(jīng)，具有溫中理氣、消腫止痛的功效，主治脘腹冷痛、小便頻數(shù)、風(fēng)濕痹痛、跌打傷痛、燙傷，其以葉片嫩綠時(shí)采摘質(zhì)量佳[1]。烏藥葉藥用歷史悠久，在歷代古文獻(xiàn)中多有記載。烏藥葉最早收載于唐代《本草拾遺》：“炙研煎飲代茗，補(bǔ)中益氣，止小便滑數(shù)?！彼巍堕_寶本草》也有記載：“烏藥……其葉及根嫩時(shí)采作茶片炙碾，服能補(bǔ)中益氣，偏止小便滑數(shù)?！泵鳌妒澄锉静荨吩唬骸敖袢瞬伞蠣T、烏藥諸葉皆可為飲，以亂茶云?！泵鳌侗静菝审堋份d：“葉采入劑，下氣亦靈。但力遲緩，須醋浸炙。”明《本草綱目》曰：“……烏藥以產(chǎn)天臺(tái)者為勝，其嫩葉炙碾煎飲代茗，補(bǔ)中益氣，止小便滑數(shù)?！鼻濉夺t(yī)林纂要》云：“溫中燥脾，消食殺蛔。治腹中寒痛。”此外，張茂江等[2]對(duì)烏藥葉的臨床應(yīng)用也有所報(bào)道，其常以烏藥葉外敷治癰疽、內(nèi)服治胃痛。

現(xiàn)代研究表明，烏藥葉中含有氨基酸與蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、甾體皂苷、酚類與糅質(zhì)、糖類、蒽醌、黃酮、香豆素與萜類內(nèi)酯、強(qiáng)心苷等化學(xué)成分[3-5]。研究[6-11]發(fā)現(xiàn)烏藥葉主要含有倍半萜類和黃酮類化合物，其中黃酮類化合物是烏藥葉發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)。然而，現(xiàn)階段有關(guān)烏藥葉的研究并不多，且其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未明，極大地限制了其臨床運(yùn)用。故而，本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定烏藥葉中4個(gè)主要的黃酮類成分含量，旨在構(gòu)建湖南省內(nèi)不同地區(qū)烏藥葉的指紋圖譜并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析，以期為研究烏藥葉后續(xù)的藥效和作用機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為提高烏藥植物資源的整體利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 烏藥新鮮葉采自湖南省長(zhǎng)沙市、湘潭市、益陽市、醴陵市、衡山縣等不同地區(qū)，共16批樣本，皆經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院歐陽榮教授鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregate(Sims)Kosterm的葉。不同產(chǎn)地烏藥葉樣本的采集地和采集時(shí)間見表1。

表1 烏藥新鮮葉采收地及采收時(shí)間

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：wkq19010203，純度：HPLC≥98%）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：wkq19040913，純度：HPLC≥98%）、異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：wkq19012403，純度：HPLC≥98%）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：wkq19031304，純度：HPLC≥98%）（四川省維克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

1.2 主要儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（美國(guó)安捷倫公司）；DYQC-30型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（連云港歐倍潔醫(yī)療設(shè)備有限公司）；WJX-A400型多功能高速搖擺粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）；AE2204電子分析天平（湖南湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0~3 min，12%A；3~26 min，12~22.5%A；26~42 min，22.5~24%A；42~45 min，24~12%A。流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：343 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取真空干燥至恒重的對(duì)照品蘆丁0.005 8 g、金絲桃苷0.005 8 g、異槲皮苷0.007 2 g和槲皮苷0.005 6 g，分別置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇，定容，使其配成蘆丁0.58 mg/mL、金絲桃苷0.58 mg/mL、異槲皮苷0.72 mg/mL和槲皮苷0.56 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將采摘的烏藥新鮮葉用清水洗凈，自然風(fēng)干，115℃殺青20 min，70℃下干燥7 h，粉碎后過0.45 mm（40目）金屬網(wǎng)篩。

精密稱取上述干燥的烏藥葉粉末1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，浸泡1 h，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液。將續(xù)濾液稀釋5倍，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，在上述色譜條件下依法測(cè)定。結(jié)果顯示，4種對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處，空白溶劑無干擾，各成分峰形較好且均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按槲皮苷計(jì)均不低于5 000。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液，將混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后，按照相應(yīng)的色譜條件測(cè)定。以待測(cè)化合物濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得到各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在定量范圍內(nèi)各化合物的線性良好，各成分回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 各成分回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取烏藥葉樣品1.0 g，按上述方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.60%、1.60%、0.94%、0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液按照上述色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.12%、1.20%、1.57%、0.28%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取烏藥葉樣品6份，每份約1.0 g，按照上述方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.82%、1.90%、1.62%、1.17%，表明重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取醴陵烏藥葉樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對(duì)照品溶液0.130、0.260、0.375、14.500 mL，再加入甲醇34.735 mL，按照上述方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，加樣回收率見表3。

表3 各成分的加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.4 HPLC法同時(shí)測(cè)定烏藥葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷的含量 將16批烏藥葉樣本按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，通過回歸方程，計(jì)算各樣本中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的含量。（見表4）

表4 不同產(chǎn)地烏藥葉藥材中黃酮類成分的含量測(cè)定（n=3）

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 取不同產(chǎn)地的16批烏藥葉，按“2.2.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，采用“2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，通過多點(diǎn)校正、全譜峰匹配，得到16批烏藥葉指紋圖譜共有模式及對(duì)照譜圖譜，見圖1。經(jīng)匹配后標(biāo)定了9個(gè)共有峰，經(jīng)過與對(duì)照品色譜圖及保留時(shí)間對(duì)比，發(fā)現(xiàn)異槲皮苷和槲皮苷峰最為明顯。

圖1 16批烏藥葉指紋圖譜圖

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 以對(duì)照?qǐng)D譜為參照，對(duì)16批烏藥葉指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果16批烏藥葉相似度為0.840~0.989，表明相似度良好。（見表5）

表5 不同產(chǎn)地烏藥葉生品相似度分析

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類分析 應(yīng)用SPSS 24.0軟件，以共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，16批烏藥葉樣本可分為4類，Ⅰ類：S3~S4，Ⅱ類：S1、S16，Ⅲ類：S2、S5、S8，Ⅳ類：S6~S7、S9~S15。其中S6~S7、S9~S15均采自湖南益陽地區(qū)，由此說明同一產(chǎn)地不同批次樣本間差異較小。Ⅰ類中S3、S4分別采自湘潭、長(zhǎng)沙；Ⅱ類中S1、S16分別采自醴陵、衡山；Ⅲ類中S2、S5采自衡山，S8采自益陽，Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類中的某些樣本雖采自不同地區(qū)，卻歸為同一類，推測(cè)可能與不同批次樣本的生長(zhǎng)環(huán)境和采收時(shí)間等有關(guān)。（見圖2）

圖2 16批烏藥葉聚類分析

2.6.2 主成分分析 應(yīng)用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析，首先篩選出特征值大于1且貢獻(xiàn)率大于85%的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異較大的2個(gè)主成分的特征值均大于1，其累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%，即這2個(gè)主成分包含了9個(gè)共有成分的89.002%的信息，符合主成分分析條件。結(jié)果烏藥葉第一主成分特征值為6.267，貢獻(xiàn)率為69.632%；第二主成分特征值為1.743，貢獻(xiàn)率為19.370%（見表6）。碎石圖結(jié)果顯示，上述的2個(gè)主成分的坡度較陡，表明這2個(gè)主成分是評(píng)價(jià)烏藥葉質(zhì)量的代表性成分（見圖3A）。以9個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA 16.0軟件，繪制主成分得分圖（見圖3B）。結(jié)果表明主成分分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，但長(zhǎng)沙地區(qū)的烏藥葉樣本不在置信區(qū)間內(nèi)，結(jié)合兩項(xiàng)分析，說明同一產(chǎn)地不同批次樣品間差異較小，不同地區(qū)烏藥葉的質(zhì)量仍存在著一定的差異。

表6 烏藥葉主成分特征值及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

圖3 16批烏藥葉主成分分析結(jié)果

3 討 論

湖南地區(qū)的烏藥植物資源十分豐富。目前，烏藥植物主要取其塊根入藥[12]，而地上部分的藥用價(jià)值尚未被開發(fā)，出現(xiàn)“湖南烏藥作柴燒”的現(xiàn)象，以致烏藥植物資源嚴(yán)重浪費(fèi)。盡管烏藥葉在歷代文獻(xiàn)中多有記載，藥用歷史悠久，但臨床上烏藥葉的藥用利用率極低?；瘜W(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，烏藥葉中含有多類成分，其中黃酮類成分是其發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)，然而烏藥葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不清。參考其他文獻(xiàn)[13-20]，本研究構(gòu)建了烏藥葉黃酮類成分含量測(cè)定方法。（1）提取方法考察方面：進(jìn)行單因素考察，對(duì)比了甲醇超聲提取與70%乙醇回流提取的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法所得烏藥葉中的黃酮類成分含量差異不明顯，且超聲提取方便、快捷，故而本研究采用甲醇超聲法制備供試品溶液。（2）HPLC方法構(gòu)建方面：①波長(zhǎng)方面，考察了250~360 nm波段，發(fā)現(xiàn)在343 nm的條件下，基線較穩(wěn)且峰形最好，最終確定343 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；②進(jìn)樣量方面，考察了10、20 μL，根據(jù)實(shí)際需要以及峰形峰寬，確定進(jìn)樣量為10 μL；③柱溫方面，考察了25~35℃，根據(jù)色譜圖峰形、峰高，確定柱溫為30℃；④流速方面，考察了1.0、1.2 mL/min，從色譜圖峰形、峰高來看，兩種流速無明顯差異，考慮到色譜柱的使用壽命，最終確定流速為1.0 mL/min。此外，在上述確定的HPLC條件下，我們對(duì)烏藥葉中的槲皮素和山奈酚也進(jìn)行了含量考察分析，發(fā)現(xiàn)其含量極低，故在本研究中未采用這兩個(gè)成分作為定量分析的指標(biāo)。本研究對(duì)烏藥葉中的4個(gè)黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示16批烏藥葉樣品中各成分的含量高低不同，說明不同地區(qū)烏藥葉的質(zhì)量存在著一定差異。

本研究通過分析湖南多個(gè)產(chǎn)地16批烏藥葉指紋圖譜，共確認(rèn)了9個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中2個(gè)重要成分，分別為異槲皮苷、槲皮苷。在色譜分析的基礎(chǔ)上，采用聚類分析對(duì)16批烏藥葉樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)具有明顯的分類趨勢(shì)，大致分為4類，其中個(gè)別樣品與同產(chǎn)地其他批次樣品差異較大，這可能與樣品采收季節(jié)等條件有關(guān)。在不同生長(zhǎng)時(shí)期，植物內(nèi)各成分的含量隨時(shí)間變化，這提示著藥材需在適宜的時(shí)間采收，才能保證藥材的質(zhì)量。我們采用主成分分析篩選出導(dǎo)致樣品不同分類差異的主成分，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.002%，說明了前2個(gè)主成分能夠概括原有數(shù)據(jù)的絕大部分信息，推測(cè)異槲皮苷、槲皮苷對(duì)主成分有較大影響，為烏藥葉的多成分含量測(cè)定提供了依據(jù)。