曾繁榮，尹家銀，唐青?！?，薛嬌雄，喻 嬌，劉雪晴，唐斯萍，楊 海，王芳宇

(1.湖南省衡陽市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 衡陽 421008；2.南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008)

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒性之一，該病由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起。以往，PRV主要引起仔豬和母豬發(fā)病，但由于長(zhǎng)期免疫壓力、病毒變異，現(xiàn)今，不同日齡豬均易感，育肥豬亦可表現(xiàn)為呼吸道綜合癥、發(fā)育障礙、死亡率較高。尤其是自2011年以來，一種由偽狂犬病毒變異毒株引起較為嚴(yán)重的母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡[1]。這些年來，我國(guó)普遍接種減毒活疫苗或基因缺失疫苗對(duì)PR的防控起到了顯著效果，盡管如此，PRV野毒依然呈地方性的流行或散發(fā)[2,3]。最近的研究表明Bartha K61株活疫苗對(duì)流行變異毒株不能提供完全保護(hù)[4]，這給PR的防控提出了新的挑戰(zhàn)。

本研究擬對(duì)一例育肥豬疑似PRV感染病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、開展病原分離鑒定和病原培養(yǎng)特性研究診斷，為臨床PR防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero細(xì)胞由南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存；PRV強(qiáng)毒陽性質(zhì)粒和PRV陽性血清由衡陽市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基Thermo Fisher Scientific公司；Premix r Taq酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；HRP-SPA購(gòu)自Invitrogen公司；AEC顯色試劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集與處理

某豬場(chǎng)育肥豬、體重約50kg、出現(xiàn)呼吸困難和死亡現(xiàn)象，結(jié)合免疫記錄，懷疑為偽狂犬野毒株感染，隨即采集發(fā)病豬的心臟、肺臟和脾臟，充分研磨，按照質(zhì)量體積比為1:5的比例加入DMEM培養(yǎng)液充分懸浮均勻，于-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，5000 r/min離心5 min，取上清，0.22μm濾膜過濾，濾液于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與PCR檢測(cè)

取1.2.1中濾液200μL，用血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒提取DNA樣本。根據(jù)文末參考文獻(xiàn)[5]合成2對(duì)PRV特異性引物PRV-gE-F/R和PRV-gG-F/R，并參考文獻(xiàn)[5]中的PCR體系和程序?qū)π呐K、肺臟和脾臟DNA進(jìn)行PRV gE基因的PCR檢測(cè)。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng)與細(xì)胞病變觀察

于病料接種前24小時(shí)，將Vero細(xì)胞按照1:6比例傳代到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，次日細(xì)胞貼壁且密度為70%～80%的匯合度時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，加入1.2.1中的濾液1.5mL，輕輕搖勻覆蓋細(xì)胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，輕輕吸出病毒液，補(bǔ)充含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脹大、融合成合包體則為PRV特征性細(xì)胞病變效益（CPE）。

1.2.4 病毒的傳代培養(yǎng)及PCR監(jiān)測(cè)

收集第1代細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融，取100μL接種到密度為80%左右、含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的健康Vero細(xì)胞（25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶）輕輕搖勻進(jìn)行傳代培養(yǎng)。后續(xù)傳代均按照這一方法進(jìn)行。取第3代、第5代和第7代次的細(xì)胞培養(yǎng)上清200μL提取DNA，采用PRV特異性引物PRV-gE-F/R和PRV-gG-F分別檢測(cè)gE和gG兩個(gè)基因，檢測(cè)方法如1.2.2步驟所述，設(shè)立健康細(xì)胞設(shè)定為陰性對(duì)照。

1.2.5 病毒在Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)

將Vero細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，代細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右，將F7代病毒培養(yǎng)物，以50μL/皿，接種細(xì)胞，留1皿作為未接毒對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)，在接毒后第4 h、第6 h、第8 h、第12 h和第24 h收1皿，根據(jù)文獻(xiàn)[5]采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法（IPMA）檢測(cè)病毒抗原。用PBS洗滌，真空干燥30 min，加入33%丙酮，固定1 h，真空干燥30 min，加入1.5 mL 1∶100倍稀釋的PRV陽性血清，37℃、1 h。PBS洗滌3次。加入1∶3000倍稀釋的酶標(biāo)二抗HRP-SPA 1.5 mL，37℃、1 h，PBS洗滌3次，加入1.5 mL AEC底物顯色液，37℃、15 min，顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病料組織的PCR檢測(cè)

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，病豬心臟、肺臟和脾臟組織為PRV-gE基因核酸陽性，陰對(duì)照和陽性對(duì)照成立（圖1），說明病料為PRV野毒核酸陽性。

圖1 病料組織中PRVg E基因的PCR檢測(cè)

2.2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)CPE觀察

如圖2所示，接種病料的Vero細(xì)胞在接種后48h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓、細(xì)胞融合成合胞體（圖2-B箭頭所指即為細(xì)胞融合的合胞體），未接種病毒對(duì)照細(xì)胞形態(tài)正常（圖2-A）。

圖2 病毒分離培養(yǎng)CPE觀察（100倍）

2.3 病毒的傳代培養(yǎng)物PCR監(jiān)測(cè)

PCR結(jié)果顯示，第3代、第5代和第7代次的細(xì)胞培養(yǎng)上清gG基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在250bp處有特異性條帶、gE基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500bp處有特異性條帶，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照成立，說明第3代、第5代和第7代次的細(xì)胞培養(yǎng)上清為PRV陽性，病毒得到穩(wěn)定傳代繁殖。

圖3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)物的PRVg E和gG基因PCR擴(kuò)增

2.4 PRV在Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)

圖4 分離病毒在Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)免疫染色檢測(cè)

通過免疫染色，結(jié)果顯示，感染后第4h無病毒特異性染色，感染后第6h一個(gè)視野下僅見個(gè)別細(xì)胞呈陽性染色，感染后第8h一個(gè)視野下出現(xiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞呈陽性染色，感染后第12h陽性染色細(xì)胞（細(xì)胞團(tuán)）數(shù)顯著增加，感染后第24h幾乎所有細(xì)胞均呈病毒抗原陽性、且感染細(xì)胞均變圓或融合。表明所分離的病毒可以被PRV陽性血清特異性識(shí)別，分離病毒為PRV，且在感染細(xì)胞6h即可通過免疫染色檢出。

3 討論

通過PCR檢測(cè)，發(fā)病豬的心臟、肺臟和脾臟組織樣品均為PRVgE基因核酸陽性，說明該病毒為PRV野毒株。脾臟組織病理接種Vero細(xì)胞48h之后，細(xì)胞變圓并發(fā)生細(xì)胞融合為合胞體，這是PRV感染細(xì)胞的特征性CPE，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。病毒在連續(xù)傳代后，采用PCR監(jiān)測(cè)gG和gE兩個(gè)基因，結(jié)果顯示，兩個(gè)基因均為第3代、第5代和第7代次的細(xì)胞培養(yǎng)上清，且細(xì)胞病變形態(tài)一致，說明PRV在Vero細(xì)胞中進(jìn)行了穩(wěn)定的傳代。以F7代病毒培養(yǎng)物為種子接種到Vero細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)行免疫染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最早在接種病毒6h個(gè)別Vero細(xì)胞中PRV抗原陽性，說明PRV在Vero細(xì)胞中復(fù)制速度很快，12h時(shí)出現(xiàn)大面積陽性，24h大部分細(xì)胞呈PRV抗原陽性、且細(xì)胞已經(jīng)大部分變圓，出現(xiàn)大面積細(xì)胞病變的時(shí)間比第一代提前了24h，可能跟持續(xù)傳代病毒適應(yīng)能力增強(qiáng)、病毒滴度上升有關(guān)。采用這種免疫染色的方法更特異性、更早地檢出細(xì)胞中的PRV抗原。而文獻(xiàn)多采用觀察細(xì)胞病變來判斷PRV增殖情況[6,7]，這一方法有兩個(gè)不足，一方面時(shí)間有延后（一般需要24h），另一方面細(xì)胞病變形態(tài)的觀察帶有較強(qiáng)主觀性，容易造成“因人而異”的結(jié)果。因此，本研究對(duì)PRV增殖動(dòng)態(tài)的免疫學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)提示，在病毒感染早期（6h～12h）即可精確進(jìn)行病毒檢測(cè)，既縮短了檢測(cè)時(shí)間又減少了對(duì)CPE的主觀誤判，可為疫苗生產(chǎn)中PRV抗原檢測(cè)提供有價(jià)值的參考。

綜上所述，本研究成功對(duì)一例臨床PRV疑似病例的病原進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室的鑒定，并成功分離鑒定了PRV病毒，闡明了該毒株在Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)，對(duì)于臨床PRV防控和PRV疫苗生產(chǎn)質(zhì)量檢定具有一定的借鑒意義。