唐達(dá)，伍濤

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

替米考星(Tilmicosin,TMC)是畜禽專用大環(huán)內(nèi)脂類抗生素[1]，是預(yù)防和治療呼吸道疾病的首選藥物[2]，市場(chǎng)份額巨大[3]。本研究選用性能穩(wěn)定[4]的腸溶性載體丙烯酸樹脂Eudragit L100和新型兩親性非離子型共聚物[5]聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)為聯(lián)合載體，制備了替米考星固體分散體(TMC SD)，使替米考星過胃、腸溶靶向控釋，有效減少口服替米考星在胃中溶解釋放而導(dǎo)致的毒副作用[6]，并與市售替米考星腸溶顆粒對(duì)比研究了其在豬體內(nèi)的生物等效性，為替米考星新制劑研發(fā)和臨床用藥提供了參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選胎次、日齡相近的三元雜交仔豬20頭，體重20±2 kg，購于重慶市榮昌區(qū)永紅種豬場(chǎng)。提前1周飼喂不含任何抗生素的全價(jià)料，給藥前停飼24 h。

1.2 藥品與試劑

替米考星標(biāo)準(zhǔn)品(含量93.9%,批號(hào):k0311407,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；替米考星原料(含量94.01%,批號(hào):TMCZ1901011,寧夏泰瑞制藥股份有限公司)；市售替米考星腸溶顆粒(含量20%,批號(hào):T1909011,湖北某動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；Eudragit L100(批號(hào):B181103223,德國(guó)EVONIK公司)；Soluplus(批號(hào)為84414368E0),購自德國(guó)巴斯夫股份公司；色譜級(jí)無水乙醇、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、二丁胺、甲醇、乙腈、丙酮等，購自重慶川東化工有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

試驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)(型號(hào):SP-1500,上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高效液相色譜儀(型號(hào):agilent1260,安捷倫)；智能溶出試驗(yàn)儀(型號(hào):ZRS-8G,上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(型號(hào):JOYN-AUTO-12D,上海喬躍電子科技有限公司)。

1.4 TMC SD的制備

精確稱取67.5 g Eudragit L100和7.5 g Soluplus到適量85%乙醇-水(v/v)溶液中，50℃水浴條件下持續(xù)攪拌1h，待澄明完全溶解后，緩慢加入25 g替米考星，繼續(xù)攪拌直至完全溶解后，再攪拌1h。保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，將該混合物溶液用噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥[7-9]，過4號(hào)篩，即得TMCSD。

1.5 給藥方案及采樣設(shè)計(jì)

隨機(jī)將試驗(yàn)動(dòng)物平均分為2組。試驗(yàn)當(dāng)天，分別將替米考星固體分散體與市售替米考星腸溶顆粒以10 mg/kg·b.w.（以替米考星計(jì)）一次性拌料給藥，給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h后于前腔靜脈采取血樣5 mL，旋轉(zhuǎn)迅速轉(zhuǎn)移至EDTA抗凝管混勻，放置于-20℃條件下保存。將2 mL血漿樣品添加至8 mL乙酸/乙腈（1∶99）混合溶液中，渦旋1分鐘，靜置于45℃環(huán)境下10 min，10000 r/min、4℃離心10 min，取上清液并在45℃氮?dú)獯蹈桑?mL甲酸（0.1%）溶液復(fù)溶，用0.22mm有機(jī)膜過濾后，取20μL進(jìn)行HPLC分析。

1.6 色譜工作條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6×150mm,5μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相為乙腈/5mM甲酸銨+0.1%甲酸（20/80；V/V）；紫外檢測(cè)器吸收波長(zhǎng)：289nm；柱溫：30℃。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限及定量限

取空白血漿按不同比例加入替米考星標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10μg/mL系列質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品，按上述血樣處理方法并進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.8 精密度和回收率

利用空白血漿添加替米考星標(biāo)準(zhǔn)工作液制備低（0.1μg/mL）、中（1.0μg/mL）、高（5.0μg/mL）三個(gè)濃度的質(zhì)量樣品，并進(jìn)行HPLC檢測(cè)；每一濃度梯度進(jìn)行3平行分析，將獲得的色譜峰面積帶入回歸方程計(jì)算回收率；將三梯度樣品分別于日內(nèi)、日間不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定（n=5），并計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算替米考星在仔豬體內(nèi)的血藥濃度，并獲得相應(yīng)血藥濃度-時(shí)間曲線，用PKSolver 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)模型擬合并給出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并計(jì)算生物利用度[10-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察

HPLC進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)該方法分離效果好（血漿雜質(zhì)峰與替米考星兩主峰完全分離無干擾（圖1、圖2）且出峰迅速（替米考星反式異構(gòu)體與順式異構(gòu)體保留時(shí)間分別為7.405±0.17 min、8.725±0.022 min），可用于替米考星生物樣品的HPLC檢測(cè)。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 含藥血漿樣品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及精密度

當(dāng)血漿中替米考星濃度在0.05～10.00μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積（順反式異構(gòu)體峰面積之和）與藥物濃度之間的線性關(guān)系良好（圖3），線性回歸方程為y=76741.01x+1103.38，r2=0.9992（n=7）；檢測(cè)限(LOD)：0.0014μg/mL、定量限(LOQ)：0.0036μg/mL；日內(nèi)精密度2.57%～3.84%，日間精密度4.14%～5.32%；樣品的平均回收率為90.9%～97.9%；綜上，該方法精密度良好，回收率高，滿足替米考星在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)分析要求。

圖3 替米考星血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 替米考星固體分散體在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及生物等效性評(píng)價(jià)

替米考星腸溶顆粒組（黑點(diǎn)）及固體分散體組（紅點(diǎn)）藥時(shí)曲線見圖4，經(jīng)PKSolver 2.0計(jì)算獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表1），兩組替米考星在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為均符合一級(jí)吸收一室開放模型。由表1可知，用Eudragit L100和Soluplus作為聯(lián)合載體制備的TMC SD，較普通替米考星腸溶顆粒其Cmax由1.53±0.26μg/mL提高至1.81±0.19μg/mL，Tmax由2.72±0.14 h降低至2.55±0.21 h，可見TMC SD在吸收速率及程度上均有所提高；T1/2由17.19±0.66 h提高至22.61±0.75 h，CLB由1.72±0.29 L/h/kg降低至1.49±0.22 L/h/kg，MRT由16.85±1.10 h提高至20.74±1.35 h，既體現(xiàn)了TMC SD消除較普通腸溶顆粒更慢，且有效血藥濃度持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)；對(duì)TMC SD組及普通腸溶顆粒組的AUC0-t、Cmax、Tmax進(jìn)行顯著性分析，三參數(shù)組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；根據(jù)相對(duì)生物利用度（F）計(jì)算公式：F=AUC0-t（受試）/AUC0-t（參比）×100%，TMC SD相對(duì)替米考星腸溶顆粒的生物利用度為136.5%，具有更高的生物利用度。

圖4 替米考星固體分散體在豬體內(nèi)的藥物-時(shí)間曲線圖

表1 替米考星腸溶顆粒及替米考星固體分散體在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

豬口服替米考星后，由于其水溶性差、溶出度低，難以通過胃腸道黏膜進(jìn)入體循環(huán)，導(dǎo)致生物利用度低下，而關(guān)于豬體內(nèi)替米考星相關(guān)制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究較少，僅見于磷酸替米考星[15、16]、腸溶性包衣顆粒和微囊微球[17]，此外，魏開赟[18]制備了替米考星緩釋腸溶粉，并開展了其在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及體內(nèi)外相關(guān)性研究，但文章并未對(duì)其制備方法進(jìn)行說明。目前，市面上常規(guī)的替米考星腸溶顆粒將其靶向于腸道內(nèi)釋放，但僅使藥物在靶部位濃集，并未改變替米考星的物理特性，故提高藥物吸收及生物利用度有限。通過選擇合適的載體將藥物制成固體分散體后，可大幅度提高藥物的溶出度和生物利用度，如鄭碧瑩[19]等用泊洛沙姆188作為載體制備的鹽酸舍曲林固體分散體，5min內(nèi)累計(jì)溶出度達(dá)90%，顯著高于原料藥及物理混合物；武倩[20]等用聚乙烯吡咯烷酮作為載體制備的齊墩果酸固體分散體在45min累積溶出度高達(dá)92.43%，同時(shí)有效改善機(jī)體對(duì)藥物的吸收，提高其生物利用度。

本試驗(yàn)選用的腸溶性載體材料Eudragit L100，具有腸靶向性，且表面積大、潤(rùn)濕性好及粒徑小等優(yōu)點(diǎn)，能將替米考星以無定型狀態(tài)均勻分散。同時(shí)，加入了具有增溶、抑晶、空間穩(wěn)定等作用的聯(lián)合載體Soluplus，其在提高難溶性藥物溶出速率和生物利用度等方面展示出了良好的應(yīng)用前景，具有一定的表面活性，且適于噴霧干燥法制SD[5]。從試驗(yàn)結(jié)果來看，將替米考星制備成腸溶性固體分散體后可進(jìn)一步提高藥物進(jìn)入血液循環(huán)的量，較常規(guī)腸溶顆粒其吸收程度更佳，消除更緩慢，有效血藥濃度持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，且相對(duì)生物利用度為普通腸溶制劑的1.36倍，故相較于替米考星同類產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。