尹 雪，劉 娜，馮俊強

(大慶龍南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 大慶 163000)

強直性肌營養(yǎng)不良(DM)是最常見的致死性單基因疾病之一，根據(jù)不同基因重復(fù)擴增所致分為DMⅠ型和DMⅡ型，二者都具有常染色體顯性遺傳和多系統(tǒng)特征，包括強直性肌病、白內(nèi)障和心臟傳導(dǎo)疾病[1-3]。目前該病在臨床診斷中易出現(xiàn)誤診、漏診，因此探究該病的致病機制對于該病的早期精準(zhǔn)確診、治療具有重要意義。

蛋白激酶C(PKC)是一種在所有類型的細(xì)胞中均可表達(dá)的相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶。PKC的功能包括基因表達(dá)、細(xì)胞遷移、增殖、分化和凋亡。此外，PKC還與心力衰竭、糖尿病和帕金森氏病以及炎癥和免疫等常見疾病的病理生理過程有關(guān)[4]。據(jù)報道[5-7]，DM是由CUG重復(fù)RNA轉(zhuǎn)錄引起，導(dǎo)致肌肉盲樣的螯合和CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白(CUGBP1)的異常表達(dá)，并且PKC信號通路在DM中發(fā)生過度磷酸化，但是該信號通路的活性與DM骨骼肌纖維的病理特征及CUGBP1表達(dá)之間的關(guān)系尚未清楚。本研究旨在探究DM骨骼肌纖維病理特征與PKC/CUGBP1信號通路之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年2月在大慶龍南醫(yī)院確診的DM患者11例(DM組)，均為黑龍江省大慶市一個DM罹患家系成員，所有患者均簽署知情同意書，均行開放式骨骼肌活檢取材。診斷標(biāo)準(zhǔn)：1)中青年開始發(fā)病，病程緩慢；2)臨床癥狀為肌強直、無力、萎縮；3)肌電圖顯示強直電位；4)肌肉病理符合強直性肌營養(yǎng)不良。臨床癥狀：9例DMⅠ型患者最初表現(xiàn)為四肢無力、抓握、抬腿、張口咀嚼、閉眼困難，視力衰退；2例DMⅡ型患者進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)多系統(tǒng)受累，表現(xiàn)為心臟受累、糖尿病、智力低下、白內(nèi)障、性功能障礙等。ELISA實驗室檢測11例患者血清肌酸激酶含量表現(xiàn)顯著升高，平均為(323.01±30.12)U·L-1。

選取同期在本院行骨折手術(shù)治療患者11例(正常組)，經(jīng)檢查確認(rèn)均無肌不良癥狀，骨折手術(shù)治療時行骨骼肌活檢取材。

1.2 檢測方法

1.2.1 病理學(xué)表現(xiàn)

截取肌纖維的橫切面，進(jìn)行組織化學(xué)染色(HE、MGT、NSE、NADH-TR、ACP、ATP)，在顯微鏡下用200～400放大倍數(shù)觀察視野內(nèi)肌纖維病理變化(包括肌纖維直徑及肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內(nèi)移、嗜堿性肌漿塊發(fā)生情況)。免疫組織化學(xué)法觀察組織中膜蛋白的變化。

1.2.2 PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達(dá)水平

運用蛋白免疫印跡法檢測肌肉組織中PKC信號通路的關(guān)鍵蛋白PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1的表達(dá)變化情況。選取病變程度中等適中的肱二頭肌肌腹(避免選擇過輕或過重萎縮病變的肌肉肌腹，因其所提供的信息可能因病變過輕導(dǎo)致病理進(jìn)程變化不典型或病變過重導(dǎo)致信息大量喪失無法觀察到典型病理改變)→局部浸潤麻醉→切開皮膚，暴露深筋膜，切開深筋膜暴露肌膚→孤立、提取直徑約1.0 cm 的肌纖維束→置于生理鹽水濕紗布上修剪塑形→耦合劑包埋→液氮冷凍→切片機切片，厚度7 μm恒冷切片備用。將備好的各個組織塊在無菌條件下充分研磨，用2倍組織體積的無菌水混勻，離心，棄沉淀，取上清。再用RIPA蛋白裂解液(來自北京百奧萊博)處理組織使組織在低溫下充分裂解。提取組織中的總蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒(來自上海生工生物)進(jìn)行蛋白定量，100 ℃沸水浴變性處理10 min。取變性的蛋白上清液50 μg上樣，用SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白。將瓊脂膠上的蛋白在4 ℃冰箱中使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用2.5%的脫脂奶粉37 ℃下封閉處理30 min。將1:1000倍稀釋的兔抗PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1抗體(來自上海艾博抗)浸泡PVDF膜，置于4 ℃冰箱中孵育12 h，結(jié)束后取出洗滌3～5次。再次轉(zhuǎn)移至1:500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(來自北京中西華大)溶液中，37 ℃孵育30 min。取出充分清洗，使用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理，最后使用Image J分析目的條帶的灰度值與GAPDH的灰度值之間的比值，表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差分析檢驗，將符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；病理變化的頻率用百分?jǐn)?shù)(%)表示。正常組和DM組PKCδ、p-PKCδ的蛋白表達(dá)水平比較采用獨立樣本t檢驗；對11例DM組患者肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內(nèi)移、嗜堿性肌漿塊發(fā)生率與PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達(dá)水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌病理學(xué)表現(xiàn)

1)HE染色結(jié)果顯示：正常組骨骼肌組織未見病理學(xué)改變(圖1A)。6例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維結(jié)締組織大量增生，以致肌纖維松散排布，發(fā)生空泡樣變；3例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維大小不一，有原形和多邊形，出現(xiàn)肌纖維異常(小的為發(fā)生萎縮，大的為發(fā)生肥大)，伴有不同程度的壞死或肌漿塊；4例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌纖維核聚集，形成核袋或核鏈(圖1B)。2)MGT染色結(jié)果顯示：7例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌組織出現(xiàn)紅色的纖維破碎片(圖1C)。3)NADH-TR染色結(jié)果顯示：4例DMⅠ型患者和1例DMⅡ型患者肌纖維出現(xiàn)蟲蝕樣變，發(fā)生萎縮變小的肌纖維深染成藍(lán)色肌漿塊(圖1D)。4)NSE染色結(jié)果顯示：11例DM患者萎縮變性的肌組織可見明顯深染(圖1E)。5)ACP染色結(jié)果顯示：8例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者肌組織酸性磷酸酶活性發(fā)生明顯升高(圖1F)。6)ATP染色結(jié)果顯示：9例DMⅠ型患者肌纖維出現(xiàn)選擇性Ⅰ型萎縮(圖1G)，2例DMⅡ患者肌纖維出現(xiàn)選擇性Ⅱ型萎縮(圖1H)。7)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：9例DMⅠ型患者和2例DMⅡ型患者患者的膜蛋白表達(dá)未出現(xiàn)異常(圖2)。

A：正常組HE染色(×400)；B：DM組HE染色(×400)；C：DM組MGT染色(×400)；D：DM組NADH-TR染色(×400)；E：DM組NSE染色(×200)；F：DM組ACP染色(×200)；G：DMⅠ型患者ATP染色(×200)；H：DMⅡ型患者ATP染色(×200)。

A：Dystrophin-C染色膜蛋白；B：Dysferlin染色膜蛋白。圖2 免疫組織化學(xué)表現(xiàn)(×200)

11例DM患者肌纖維萎縮發(fā)生率在5.25%～30.50%之間，肌纖維肥大發(fā)生率在0.00%～9.67%之間，肌纖維核內(nèi)移發(fā)生率在16.50%～92.75%之間，嗜堿性肌漿塊發(fā)生率在0.00%～5.50%之間，見表1。

表1 11例DM患者骨骼肌病理變化

2.2 PKC/CUGBP1信號通路關(guān)鍵蛋白PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1的表達(dá)

與正常組比較，DM組肌肉組織中PKCδ蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.001)，見圖3、表2。

A：PKCδ、p-PKCδ蛋白表達(dá)；B：CUGBP1蛋白表達(dá)。圖3 PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白電泳圖

表2 2組PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 DM患者PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達(dá)與病理特征的相關(guān)性分析

DM患者p-PKCδ、CUGBP1表達(dá)與肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內(nèi)移發(fā)生率均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)，與嗜堿性肌漿塊發(fā)生率、膜蛋白異常率均無明顯相關(guān)(均P>0.05)。DM患者PKCδ表達(dá)與肌纖維萎縮、肌纖維肥大、肌纖維核內(nèi)移、嗜堿性肌漿塊發(fā)生率及膜蛋白異常率均無明顯相關(guān)(均P>0.05)。見表3。

表3 DM患者PKCδ、p-PKCδ、CUGBP1表達(dá)與病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

DM是成年人中最常見的肌營養(yǎng)不良癥，其原因是CTG或CCTG重復(fù)序列的基因組擴增不穩(wěn)定，包含擴展重復(fù)序列的突變RNA轉(zhuǎn)錄物會干擾細(xì)胞核中的剪接因子，從而導(dǎo)致毒性功能獲得及替代性的前mRNA剪接失調(diào)。該病的表現(xiàn)具有高度的可變性，并且可通過發(fā)病年齡和癥狀的嚴(yán)重程度區(qū)分[8]。其發(fā)病率極低且具有顯性遺傳的特性，即只要具有患病基因就會表現(xiàn)癥狀。癥狀的輕重與患者攜帶顯性基因的數(shù)目相關(guān)[9-10]。雖然已有研究[5-7]證明PKC信號通路的活性會影響CUGBP1基因的表達(dá)水平，但是二者與患者的病理特征之間的關(guān)系尚未清楚。

PKC、CUGBP1參與DM的發(fā)生發(fā)展過程。唐迎龍[11]報道，CUGBP1不僅在DM中發(fā)揮重要作用，其還通過調(diào)控RyR1進(jìn)而影響鈣的釋放，導(dǎo)致骨骼肌萎縮。據(jù)報道[12]，在DMⅠ骨骼肌中LIM域結(jié)合3(LDB3)外顯子11發(fā)生異常，其可以通過轉(zhuǎn)染CTG重復(fù)序列擴展的基因來復(fù)制；此外，LDB3外顯子11陽性與外顯子11陰性相比，其對PKC的親和力顯著降低；由于PKC在DMⅠ中表現(xiàn)出過度活化并通過磷酸化穩(wěn)定CUGBP1，因此LDB3的異常剪接可能會通過改變其對PKC的親和力來促進(jìn)CUGBP1的上調(diào)。也有研究[13]報道，PKC抑制劑可影響CUGBP1家族成員CELF1的過度磷酸化改善DMⅠ小鼠模型的心臟表型，其作用機制與PKC抑制劑消除了核病灶，降低了CELF1的蛋白表達(dá)水平有關(guān)，與PKC信號通路活性無關(guān)。近期，陳慧敏[14]在探究DM分子生物學(xué)發(fā)病機制中報道，核聚體結(jié)構(gòu)為肌盲蛋白1與RNA發(fā)卡二級結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使游離MBNL1下降，異常擴增的核苷酸重復(fù)序列過度激活PKC信號通路的磷酸化過程，使DMⅠ型肌細(xì)胞中CUGBP1的表達(dá)水平異常升高。本研究通過組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色觀察骨骼肌組織的病理特征，并檢測其PKCδ、p-PKCδ的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，p-PKCδ的表達(dá)水平與肌纖維萎縮、肥大、核內(nèi)移呈正相關(guān)。這說明PKC信號通路的活性在DM患者骨骼肌中異常降低，這種情況與患者的病理特征(肌纖維萎縮、肥大、核內(nèi)移)之間呈正相關(guān)。這與陳慧敏[14]的研究結(jié)果一致，再次證實了該信號通路在DM中的調(diào)控功能。本研究檢測了患者骨骼肌組織中CUGBP1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUGBP1在患者骨骼肌組織中的表達(dá)水平異常升高，說明CUGBP1與p-PKCδ之間可能存在正向相關(guān)關(guān)系，即PKC信號通路的磷酸化程度會影響下游基因CUGBP1的表達(dá)水平。此研究結(jié)果揭示了DM患者的病理特征與PKC/CUGBP1信號通路之間的聯(lián)系，暗示PKC/CUGBP1信號通路可作為診斷、治療DM的潛在生物靶標(biāo)。值得注意的是，該研究還發(fā)現(xiàn)肌纖維萎縮、肥大、核內(nèi)移與CUGBP1的表達(dá)水平也呈顯著的正相關(guān)，這說明CUGBP1基因的表達(dá)量與患者的病理特征嚴(yán)重程度之間呈正相關(guān)。

綜上所述，強直性肌營養(yǎng)不良骨骼肌的病理特征與PKC/CUGBP1信號通路的活性存在緊密聯(lián)系，為DM的治療提供理論依據(jù)。