邱 萍，黎 帆，何田爽

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330047)

尿酸是人體中普遍存在的生物分子。由于人體中缺少催化尿酸氧化的尿酸氧化酶[1]，所以它也是嘌呤代謝的最終代謝物之一。正常生理?xiàng)l件下，人體血清中尿酸濃度為120～460 μmol·L-1，而在尿中為1.4～4.4 μmol·L-1[2-3]。體液里的尿酸含量維持在健康水平是極為重要的，因?yàn)槟蛩岬漠惓舛瓤梢砸鸹蚍从吵鲈S多疾病。比如高尿酸水平會增加心血管疾病、痛風(fēng)、原發(fā)性高血壓、腎臟疾病、帕金森病等疾病的風(fēng)險[4-7]。并且，極低的尿酸濃度可能會導(dǎo)致多發(fā)性硬化癥[8]。

因此，開辟一條快速、靈敏的檢測尿酸的途徑是具有意義重大的。到目前為止，已有多種技術(shù)用于尿酸的定量分析，如高效液相色譜[9]、熒光[10]、電化學(xué)技術(shù)[11]、紫外吸收[12]、比色法[13]、化學(xué)發(fā)光[14]、表面增強(qiáng)拉曼光譜[15]等。光分析法以其靈敏度高、快速和簡便優(yōu)點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注。其中，比率熒光技術(shù)能得到的定量結(jié)果更為可靠[16]，不失為一個較好選擇。由于比率分析法可以通過建立兩組不同的信號，從而有效地使變量歸一化。這可以有效地減少儀器和環(huán)境的影響，特別是在復(fù)雜的生物環(huán)境中，提高信噪比，以此來使定量更加可靠[17]。要獲得雙發(fā)射信號，可以通過比較探針和產(chǎn)物的熒光來實(shí)現(xiàn)。碳點(diǎn)是一種新興的碳基納米材料，具有熒光強(qiáng)度高、光學(xué)穩(wěn)定性好、合成操作簡單、毒性低、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[18]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，摻雜是控制納米材料性能的優(yōu)良策略[19]。胺分子作為表面鈍化劑和氮摻雜源，在合成碳點(diǎn)過程中加入胺分子合成摻氮碳點(diǎn)，這種方法可以改善碳點(diǎn)本身的光學(xué)和電學(xué)性能。

據(jù)此，我們建立了基于氮摻雜碳點(diǎn)(N-CDs)的比率熒光法，利用2,3-二氨基吩嗪(DAP，產(chǎn)物)與碳點(diǎn)(探針)的熒光強(qiáng)度比(I580/I427)檢測尿酸。在傳感分析中，碘化物較為常見，價格低廉，具有類過氧化物酶活性[20,21]，是一種理想的過氧化物酶模擬試劑?；诖耍贗-存在下，由尿酸產(chǎn)生的H2O2催化生成羥基自由基(·OH)，進(jìn)而氧化鄰苯二胺(OPD)生成DAP。DAP利用內(nèi)濾光效應(yīng)(IFE)猝滅了N-CDs在427 nm處的熒光發(fā)射，并在580 nm處產(chǎn)生新峰。我們采用DAP與N-CDs的熒光強(qiáng)度比(I580/I427)可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中尿酸含量的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

尿酸、尿酸酶、尿素、葡萄糖、肌酐、多巴胺和谷胱甘肽購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。鄰苯二胺、組氨酸和苯丙氨酸來源于上海麥克林生化科技有限公司。二亞乙基三胺來自TCI上?；ぐl(fā)展有限公司。所使用的化學(xué)品都是分析純，整個實(shí)驗(yàn)過程中都使用超純水。

熒光光譜由日立F-4600熒光光譜儀(日本)在330 nm的激發(fā)下獲得。紫外-可見吸收光譜來自安捷倫Cary 8454紫外-可見分光光度計(美國)的記錄。粒徑分布由布魯克海文粒度分析儀(美國)測得。熒光壽命曲線采用愛丁堡穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀FLS1000(英國)得到。

1.2 N-CDs的合成

N-CDs是采用水熱法制備[22]。首先將1.2 g檸檬酸完全溶解在20 mL的超純水中。0.15 mL二亞乙基三胺加入到上述混合液中，隨后超聲15 min。將混合完的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中,置于200 ℃烘箱里反應(yīng)14 h。冷卻至室溫后取出，由此產(chǎn)生的褐黃色產(chǎn)品是通過透析膜透析時間超過3 d得到的。最后，通過冷凍干燥法得到粉末狀的N-CDs，并在室溫下保存。

1.3 尿酸檢測

將50 μL不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)液和50 μL尿酸酶(100 μg·mL-1)依次加入100 μL Britton-Robinson緩沖液(pH 8.5)中。混合物在37 ℃下穩(wěn)定15 min后，再依次加入200 μL OPD(25 mmol·L-1)，200 μL I-(14 μmol·L-1)，60 μL N-CDs溶液(400 μg·mL-1)和1 340 μL磷酸鹽緩沖液(pH 5.5)。在45 ℃下，再恒溫反應(yīng)30 min。在330 nm激發(fā)下進(jìn)行比率熒光分析，激發(fā)和發(fā)射模式下的狹縫寬度均為5.0 nm。

1.4 實(shí)際樣品的處理

取南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院提供的血清樣，4 000 r·min-1離心15 min，提取上清液，用磷酸鹽緩沖液稀釋5倍備用。同時，我們采用生化分析儀對該血清樣進(jìn)行了檢測，以便進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。在該法中，血清樣品在4 000 r·min-1下離心3 min，取上清液(5.6 μL)將尿酸酶、4-氨基安替比林(4-AAP)和3-二苯胺二鈉鹽(MADB)混合。然后，用分析儀在660/800 nm波長下進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-CDs的表征

通過透射電鏡對合成的N-CDs的形貌和尺寸進(jìn)行了分析。從圖1a中可以看出，N-CDs呈均勻的球形，在水溶液中具有良好的分散性，平均粒徑大約為2.8 nm(圖1b)。其中，高分辨透射電鏡圖顯示N-CDs的晶格間距為0.21 nm。通過紅外分析(圖1c)對所制備的N-CDs鍵合方式和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征?！H拉伸振動在3 429 cm-1處產(chǎn)生了較寬的吸收帶。此外，在2 900 cm-1附近的峰值歸因于C-H烷基的伸縮振動。在1 681 cm-1處有明顯的峰，表明N-CDs表面存在C-O鍵。1 581和1 425 cm-1以及1 028 cm-1處的吸收帶分別對應(yīng)于C-C和C-N以及C-O振動帶。說明已成功合成了N-CDs。

2.2 N-CDs的光學(xué)性質(zhì)

圖2a為制備的N-CDs的紫外-可見吸收光譜。在277和321 nm處有兩個明顯的吸收峰，分別與碳sp2的π-π*躍遷和C=O帶的n-π*躍遷有關(guān)。同時可以看出，N-CDs的發(fā)射峰由激發(fā)波長決定(圖2b)。這種依賴激發(fā)峰的特性是由帶隙中的新能級引起的。當(dāng)激發(fā)波長從290增加到360 nm時，發(fā)射峰出現(xiàn)紅移。激發(fā)波長為330 nm時，N-CDs的發(fā)射峰最強(qiáng)中心為430 nm。此外，它也具有良好的熒光穩(wěn)定性。從圖2c可以看出，在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液(4.7～7.4)中，N-CDs的熒光強(qiáng)度在14 d內(nèi)并沒有明顯下降。因此，合成的N-CDs是可以用于接下來的實(shí)驗(yàn)。

Diameter/nm

λ/cm-1圖1 N-CDs的TEM(a);粒徑分布圖(b);紅外表征圖(c)

λ/nm

λ/nm

t/d圖2 N-CDs的光學(xué)性質(zhì)

2.3 檢測原理

圖3說明了基于I-和尿酸酶使用N-CDs作為熒光探針的方法基本原理。首先，尿酸酶催化尿酸(UA)生成H2O2。OPD在H2O2存在下可被I-催化氧化生成產(chǎn)物DAP。在330 nm的激發(fā)波長下，生成的DAP可以在427 nm處猝滅N-CDs體系中的熒光發(fā)射，而在580 nm(DAP所產(chǎn)生的熒光峰位)處發(fā)射熒光增強(qiáng)，導(dǎo)致不同UA濃度下的熒光發(fā)生變化。最后，利用DAP/N-CDs的熒光強(qiáng)度比(I580/I427)測定UA的濃度。

圖3 比率熒光法的檢測原理

為了研究OPD誘導(dǎo)N-CDs熒光猝滅的可能機(jī)理，進(jìn)行了幾種測定。如圖4a所示，DAP的吸收光譜不僅在427 nm處與N-CDs的發(fā)射光譜有很大的覆蓋區(qū)域，而且在330 nm處與激發(fā)光譜有重疊，這說明可能存在內(nèi)濾光效應(yīng)(IFE)或者F?rster-resonance-energy轉(zhuǎn)移(FRET)。為了探究這一機(jī)理，我們同時測量了N-CDs在沒有DAP和存在DAP的情況下的熒光壽命。結(jié)果顯示，熒光壽命沒有明顯變化(圖4b)，說明N-CDs與DAP之間沒有發(fā)生能量轉(zhuǎn)移過程。在圖4c中，DAP和N-CDs的zeta電位分別為-1.1和-2.6 mV。結(jié)果表明，DAP和N-CDs的zeta電位均為帶負(fù)電，證實(shí)DAP和N-CDs之間幾乎不存在靜電吸引。此外，由于相同電荷之間發(fā)生靜電排斥，N-CDs與DAP之間的距離往往大于10 nm。我們都知道，在FRET的情況下，熒光供體與受體之間的距離應(yīng)不超過10 nm。因此，上述結(jié)果表明，DAP利用IFE猝滅了N-CDs的熒光發(fā)射。

λ/nm

t/ns

圖4 OPD的氧化物猝滅N-CDs的機(jī)制

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

相關(guān)反應(yīng)條件的優(yōu)化對于提高傳感器的靈敏度具有重要作用。根據(jù)前期工作，我們認(rèn)為尿酸酶催化尿酸的反應(yīng)最適宜條件是在pH為8.5的環(huán)境中,在35 ℃下孵育15 min[23-24]。隨后我們研究了pH、溫度、培養(yǎng)時間、I-濃度和OPD濃度對DAP/N-CDs(I580/I427)熒光強(qiáng)度比的影響，以分析后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳測試條件。考察pH的影響可以發(fā)現(xiàn)最大強(qiáng)度比(I580/I427)在pH為5.5時。因此，后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用最適pH值5.5進(jìn)行。溫度的影響范圍為25 ℃～55 ℃時，45 ℃為理想溫度。選擇最佳孵育時間為45 min。將I-的濃度從0.2變化到1.6 mmol·L-1，OPD濃度從0.1變化到3 mmol·L-1，可以看到I-的濃度和OPD濃度在1.4和2.5 mmol·L-1時分別獲得最大的發(fā)射強(qiáng)度比。

2.5 對尿酸的分析檢測

為了證明所提出的生物傳感器的性能，我們在上述最佳條件下探索了尿酸檢測的線性范圍和檢測限。從圖5a可以看出，隨著UA濃度的增加，427 nm處的發(fā)射強(qiáng)度(I427)逐漸降低，而580 nm處的發(fā)射強(qiáng)度(I580)逐漸增強(qiáng)。在紫外光照射下，熒光光度明顯由藍(lán)色變?yōu)辄S色(圖5b)。不同UA濃度對應(yīng)的熒光強(qiáng)度比(I580/I427)在0.5～150 μmol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。線性回歸方程為I580/I427=0.001 82CUA+0.069 37，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.992(圖5a插圖)，說明比值熒光法測定尿酸具有良好的線性關(guān)系。以3 σ/s(其中σ和s分別代表估計誤差和線性回歸斜率)方法計算出檢測限(LOD)為0.06 μmol·L-1。

λ/nm

圖5 尿酸的分析檢測

2.6 選擇性實(shí)驗(yàn)

2.7 實(shí)際樣品的檢測

采用比率熒光法對血樣進(jìn)行了分析檢測，結(jié)果與生化分析儀檢測結(jié)果進(jìn)行了比較(表1)，平均相對誤差為3.3%。本法測定人血清的回收率為94.6%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)小于3.6，說明該法具有較好的準(zhǔn)確性，在實(shí)際應(yīng)用上有很大的潛能。

1～13分別代表：(1) NaCl；(2) KNO3；(3) NH4Cl；(4) Urea；(5) AA；(6) Cys；(7) Cr；(8) Glu；(9) DA；(10) GSH；(11) His；(12) Phe；(13) UA。

圖6 選擇性實(shí)驗(yàn)，

表1 實(shí)際樣品的檢測

3 結(jié)論

綜上所述，我們成功設(shè)計了一種基于N-CDs的比率熒光法測定了人體血清中尿酸含量。使用比率熒光輸出信號，使尿酸水平的定量分析更加可靠。與傳統(tǒng)酶法相比，用碘離子取代辣根過氧化物酶，大大降低了失活風(fēng)險和成本。N-CDs不需要復(fù)雜的合成技術(shù)。所制備的N-CDs具有良好的光學(xué)性能和穩(wěn)定性。該法檢測尿酸具有超靈敏、高選擇性和良好的實(shí)際應(yīng)用前景。