杜尚廣，涂序堂，熊 敏，余 波，曹文艷，徐雅楠，羅火林

(1.南昌師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330000；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330000)

木薯(ManihotesculentaCrantz)，又名樹葛，是大戟科木薯屬多年生灌木，起源于南美洲亞馬遜流域，現(xiàn)已廣泛分布于熱帶及亞熱帶區(qū)域[1-2]。木薯光合效率高、塊莖中含有大量的淀粉，是7億人賴以生存的主糧之一[3-4]，木薯在我國已有200余年的種植歷史，是廣東、廣西和海南等地區(qū)的一種重要糧食作物。隨著木薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，木薯廣泛應(yīng)用于飼料、乙醇等生產(chǎn)，現(xiàn)已成為一種重要的工業(yè)原料[5-6]。木薯喜高溫、耐干旱貧瘠，但耐寒能力差；春潮早臨及倒春寒等低溫氣候?qū)?dǎo)致木薯減產(chǎn)、嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致絕產(chǎn)，低溫現(xiàn)已成為木薯北移的主要限制因素[7-8]。目前，培育低溫耐受品種及其遺傳改良已成為世界性難題，因此克隆并研究木薯抗寒基因具有一定的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD蛋白)是植物抵抗逆境脅迫的重要酶，并在響應(yīng)低溫過程中具有至關(guān)重要的作用[9]。低溫使植物細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，引起膜脂相變、降解，甚至導(dǎo)致植物死亡[10]。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,FAs)能夠提高生物膜的穩(wěn)定性，防止變?yōu)槟z相，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[10]。SAD是一種可溶性蛋白，定位于質(zhì)體基質(zhì)，可將飽和的硬脂酰-ACP脂肪酸鏈還原成不飽和的油酰-ACP，提高植物中FAs的水平[3]。當(dāng)前研究表明，植物的耐寒能力和細(xì)胞中FAs的水平具有一定的聯(lián)系[11]。將擬南芥SAD6基因轉(zhuǎn)入突變體中，能夠顯著提高FAs的水平，并減小低溫、干旱和缺氧等逆境的傷害[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，SAD轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)植株FAs的含量增高，并且其抗寒能力明顯增強(qiáng)[13]。對擬南芥[14]、花生(Arachishypogaea)[15]和小麥(Triticumaestivum)[16]等研究表明，SAD基因在抵抗低溫脅迫過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用，但尚未有關(guān)木薯SAD基因的報(bào)道。

本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫，以擬南芥SAD同源蛋白為探針，通過電子克隆技術(shù)獲得木薯SAD基因的cDNA序列。使用生物信息學(xué)方法，對表達(dá)蛋白進(jìn)行一級至高級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析木薯SAD基因的進(jìn)化特征。因此，克隆木薯SAD基因?qū)ζ淠秃虻墓δ荑b定和遺傳改良提供參考，也為抗性品種的培育和篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 木薯MeSAD基因的cDNA獲取

以擬南芥的SAD氨基酸序列(登錄號：2281099)為探針，利用tblast在線工具搜索木薯的同源EST序列，選取一條Query cover最高、E值最低的同源序列，并以之為誘餌，利用blast在線搜索能覆蓋誘餌的EST序列，利用DNAMAN拼接，繼續(xù)blast直至無新的EST序列可拼接，得到SAD基因的全cDNA序列。本實(shí)驗(yàn)所用的EST序列包括：DV455612.1、FF381161.1、FF380418.1、DB941776.1、DB938249.1、DB938249.1、DV456201.1和DB937741.1。

1.2 理化性質(zhì)分析、疏水性/親水性分析

分別利用DNAMAN和ORF finder軟件完成cDNA和開放閱讀框(open reading frame,ORF)的翻譯和讀??；利用ProtParam tool在線工具完成蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測；利用ProtScale軟件完成蛋白質(zhì)的親水性/疏水性分析。

1.3 亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)分析、磷酸化位點(diǎn)與信號肽分析

分別利用ProtComp 9.0和TMHMM等在線工具進(jìn)行表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)的分析；分別利用NetPhos 3.1、SignalP 4.1完成磷酸化位點(diǎn)與信號肽的預(yù)測和分析。

1.4 二級及高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用NCBI的CDD在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析；利用SOPMA、SWISS-MODEL和VMD 1.9.3進(jìn)行二級及高級結(jié)構(gòu)的分析。

1.5 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用ClustalX 2.0軟件完成木薯和其他15種植物SAD蛋白序列的多重比對分析[6-7]；利用MEGA X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)化樹遺傳距離、檢驗(yàn)方法、循環(huán)次數(shù)分別設(shè)置為Kimura雙參數(shù)模型、Bootstrap method、1 000。

2 結(jié)果

2.1 基因全cDNA獲取

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，利用擬南芥SAD氨基酸序列作為探針進(jìn)行比對，選取相似度最高的序列，以之為探針繼續(xù)比對，選擇7條親緣關(guān)系較近的EST進(jìn)行拼接和衍生；得到木薯SAD基因的全cDNA序列(圖1A)。cDNA序列總長為1 685 bp，ORF為176～1 366 bp(圖1B)；翻譯蛋白含396個(gè)氨基酸，起始和終止密碼子分別是ATG和TAA。新基因命名及表達(dá)蛋白名分別為MeSAD、MeSAD。

2.2 理化性質(zhì)分析

使用ProtParam tool工具預(yù)測MeSAD蛋白的理化性質(zhì)可知。表達(dá)蛋白包含396個(gè)氨基酸，由20種氨基酸構(gòu)成，含量最高和最低的氨基酸分別為亮氨酸(9.8%)、半胱氨酸(0.8%)。分子式是C2031H3181N545O597S15、分子量是45.3 kDa；脂肪系數(shù)是81.82；負(fù)電荷殘基是58、正電荷殘基是52；等電點(diǎn)(Theoretical pI)是5.93，呈酸性；不穩(wěn)定系數(shù)是37.55；平均總親水性是-0.443。

圖1 (A)木薯SAD基因的cDNA拼接圖、(B)cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 疏水性/親水性分析

分析MeSAD蛋白的疏水性/親水性可知(圖2A)，第132位纈氨酸(Val)以及第265位的組氨酸(His)分別具有最高得分(2.522)和最低得分(-2.478)，平均疏水指數(shù)為-0.443。即該蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白。

2.4 亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)分析

分析MeSAD蛋白的亞細(xì)胞定位可知，葉綠體的積分值最大(9.28)(表1)；分析圖2B可知，該蛋白無跨膜區(qū)域。

2.5 磷酸化位點(diǎn)與信號肽分析

分析MeSAD蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)可知(圖3A)，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)目分別是19、13、5。信號肽分析可知(圖3B)，該蛋白質(zhì)無信號肽。

氨基酸位點(diǎn)

氨基酸位點(diǎn)圖2 (A) MeSAD蛋白疏水性/親水性預(yù)測、(B)跨膜區(qū)域的預(yù)測

表1 MeSAD蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

氨基酸位點(diǎn)

氨基酸位點(diǎn)圖3 (A) MeSAD蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、(B) 信號肽預(yù)測

2.6 二級及高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

分析MeSAD蛋白二級結(jié)構(gòu)可知，多肽鏈結(jié)構(gòu)中含有α螺旋(53.28%)、無規(guī)則卷曲序列(34.09%)、延伸鏈(7.58%)和β轉(zhuǎn)角(5.05%)等(圖4A)。選擇“2j2f.pdb”模板，采用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)分析，其氨基酸序列一致性為60%，覆蓋度為92%，SAD主要由α螺旋以及無規(guī)則卷曲序列構(gòu)成；使用VMD 1.9.3軟件繪制高級結(jié)構(gòu)(圖4B)。

圖4 (A) MeSAD蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、(B)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 氨基酸同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行MeSAD和其他植物的SAD氨基酸同源序列比對，木薯與蓖麻(RicinuscommunisNP_001310659.1)、巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisXP_021688869.1)、麻瘋樹(JatrophacurcasKDP44234.1)、可可(TheobromacacaoEOY04657.1)、臍橙(CitrussinensisXP_006494043.1)、溫州蜜柑(CitrusunshiuGAY44796.1)、克萊門柚(CitrusclementinaXP_006442769.1)序列一致性分別為95.71%，95.96%，95.20%，92.68%，90.66%，90.66%，90.66%。多重比對發(fā)現(xiàn)，以上物種的SAD具有很高的同源性，并且1～40序列部分同源，40～396序列高度同源(圖5A)。利用NCBI的CDD在線工具分析可知(圖5B)，SAD屬于類鐵蛋白家族，具有?；?ACP脫氫酶結(jié)構(gòu)域(3～396)，主要包括6個(gè)二鐵結(jié)合位點(diǎn)、33個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)以及14個(gè)底物結(jié)合口袋位點(diǎn)。

為探究SAD基因的進(jìn)化特征，本研究基于SAD蛋白一級序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，SAD基因的進(jìn)化和所選物種的進(jìn)化是一致的(圖5C)。木薯與蓖麻、巴西橡膠樹處于同一分支，這3種植物同屬于大戟科；樹棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)處于同一分支，這3種植物同屬于錦葵科；甜瓜(Cucumismelo)、南瓜(Cucurbitamoschata)和筍瓜(Cucurbitamaxima)同屬于葫蘆科，聚在另一分支；大豆(Glycinemax)、木豆(Cajanuscajan)和水黃皮(Pongamiapinnata)同屬于豆科，亦聚在另一分支。這與它們在植物進(jìn)化系統(tǒng)所處位置完全吻合。

圖5 (A)不同植物中SAD氨基酸序列多重比對、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測以及系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

SAD基因在植物響應(yīng)低溫脅迫中起到至關(guān)重要的作用[17]。迄今為止，SAD蛋白是植物中唯一發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)去飽和酶，SAD催化硬脂肪酸脫氫生成油酸，油酸被運(yùn)輸至類囊體或細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步去飽和，以此提高其抗寒水平[17]。關(guān)于SAD基因的脂質(zhì)去飽和化研究現(xiàn)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)的科研熱點(diǎn)，克隆SAD基因具有十分重要的意義[18]。

以往研究表明，SAD蛋白是植物中較為保守的一類蛋白，具有典型的同型二聚體結(jié)構(gòu)以及4個(gè)α螺旋與Fe2+結(jié)合構(gòu)成的活性中心[19-21]，本研究發(fā)現(xiàn)木薯的預(yù)測蛋白中具有這類典型的結(jié)構(gòu)。SAD蛋白主要是靠三級結(jié)構(gòu)的Fe2+活性中心來行使功能[22-24]，這說明木薯預(yù)測蛋白具有SAD的功能。

在GENEBANK數(shù)據(jù)庫中，SAD蛋白的預(yù)測結(jié)果有兩個(gè)，登錄號分別為XP_021610569和XP_021628521。這兩條序列是通過二代基因組測序預(yù)測而來的，成本高昂，并耗費(fèi)大量的人力和物力。本研究所預(yù)測的蛋白質(zhì)序列是基于公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列拼接的，零成本地預(yù)測SAD蛋白序列。經(jīng)過與GENEBANK數(shù)據(jù)庫中已有序列相比，和其一致性分別為98%和95%，這表明電子克隆可經(jīng)濟(jì)有效地預(yù)測基因序列。

本研究利用電子克隆技術(shù)克隆木薯SAD基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具有一定的科學(xué)意義。本研究的結(jié)果擬為木薯基因克隆、表達(dá)及干擾載體構(gòu)建提供參考，并為木薯SAD轉(zhuǎn)基因研究、抗寒機(jī)理闡述以及品種改良奠定基礎(chǔ)。