周 葉，王小敏，洪一江

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031;2.江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330031)

白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶(Interleukin(IL)-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[1]，在toll樣受體(TLR)和IL-1受體(IL-1r)[2]信號(hào)通路中起重要的支架和磷酸化作用[3]。TLR和I-1R是模式識(shí)別和細(xì)胞因子受體的兩個(gè)大家族，分別參與了炎癥和免疫信號(hào)對(duì)宿主機(jī)體的保護(hù)[4-5]。TLRs能夠識(shí)別病原體或各種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，如TLR4識(shí)別LPS。TLR4識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁，通過(guò)脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)識(shí)別，并單體化脂多糖多聚體，促進(jìn)TLR4二聚化和隨后的快速信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)CD14和TLR4-MD-2受體復(fù)合物實(shí)現(xiàn)細(xì)胞識(shí)別[6-10]。CD14和TLR4-MD-2受體復(fù)合物對(duì)于TLR4應(yīng)答于LPS是不可或缺的[11-12]。當(dāng)TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合MyD88后，MyD88通過(guò)一個(gè)稱為“myddosome”的復(fù)雜死亡結(jié)構(gòu)域(DD)招募白介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族成員，IRAK1、IRAK2、IRAK3(或IR AKM)和IRAK4[13]。

IRAK4是IRAK亞型中最上游的激酶，它通過(guò)絲氨酸和蘇氨酸殘基的反式自磷酸化招募RAK1或IRAK2。IRAK1或IRAK2依次招募組建到腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)以及傳遞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致活化NF-κB和激活MAP[2,14]。最終調(diào)控炎癥基因轉(zhuǎn)錄以及形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)控IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子[15]。IRAK4在Toll樣受體(TLR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著支架和磷酸化的重要功能[16]。在刺激下，MyD88和TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域相作用，MyD88再通過(guò)兩個(gè)分子Death結(jié)構(gòu)域的相互作用，IRAK4被募集到MyD88上。近幾年來(lái)，IRAK4的功能在宿主免疫信號(hào)通路中的重要性引起了人們的廣泛關(guān)注。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明，IRAK4缺陷小鼠對(duì)LPS和CPG誘導(dǎo)的休克完全耐受，并且對(duì)病毒和細(xì)菌攻擊的反應(yīng)嚴(yán)重受損，這是因?yàn)槭軗p的TLR/IL-1R介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子以及趨化因子的誘導(dǎo)所引起的[17-18]。，表明IRAK4可能參與先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。IRAK4與IRAK1和TRAF6相互作用，其過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)NF-κB和MAP激酶通路激活[20]。然而，Qin等[21]發(fā)現(xiàn)，在人IRAK4缺陷細(xì)胞與野生型或不具激酶活性的IRAK4重組，其TLR/IL-1介導(dǎo)的信號(hào)通路沒(méi)有差異。令人驚訝的是，在IRAK4 D329A突變體的研究中，發(fā)現(xiàn)D329A突變體與IRAK1的關(guān)聯(lián)顯著減弱，降低了修飾IRAK1的水平，表明IRAK4激酶活性僅部分負(fù)責(zé)IRAK1的修飾，IRAK4支架活性在IRAK1的修飾中起主要作用[22]。同時(shí)Saurav等人還發(fā)現(xiàn)IRAK4激酶活性對(duì)調(diào)節(jié)MyD88、IRAK4和IRAK1與IRAK4激酶活性之間的相互作用很重要，削弱IRAK4和MyD88之間的相互作用[22]。另外，在草魚(yú)中通過(guò)核細(xì)胞溶質(zhì)提取分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)CiIRAK4對(duì)草魚(yú)細(xì)胞中和轉(zhuǎn)錄因子κBp65的核轉(zhuǎn)位幾乎沒(méi)有影響，但能促進(jìn)IRF5向細(xì)胞核的易位，然而它們之間的促進(jìn)作用與IRAK4和IRF5之間的相互作用無(wú)關(guān)[23]。這些結(jié)果表明IRAK4的功能多樣。

另外，在池蝶蚌、三角帆蚌、牡蠣、和扇貝等軟體動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)它們可以應(yīng)答于LPS，但在貝類TLR4信號(hào)通路中還存在爭(zhēng)議[24-26]，在太平洋牡蠣基因組中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)MyD88-like基因和3個(gè)IRAK-like基因，其中兩種MyD88和一個(gè)IRAK4能夠發(fā)生相互作用[27-28]?？傮w而言，有關(guān)貝類MyD88、IRAK4的功能研究較少，TLR4信號(hào)通路的免疫機(jī)制還不是很清楚。池蝶蚌是本實(shí)驗(yàn)室從日本引進(jìn)的優(yōu)質(zhì)淡水珍珠蚌，為了解淡水貝MyD88依賴的信號(hào)通路和免疫的具體機(jī)制，本研究克隆了池蝶蚌IRAK4(以下簡(jiǎn)稱HsIRAK4)全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究了LPS誘導(dǎo)下的組織表達(dá)規(guī)律、HsIRAK4與HsMyD88相互作用，以期認(rèn)識(shí)池蝶蚌MyD88依賴的信號(hào)通路和免疫分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 池蝶蚌、樣品處理和收集

池蝶蚌均取自江西省撫州市池蝶蚌良種場(chǎng)。挑選3齡健康池蝶蚌，為適應(yīng)新的生活環(huán)境，需在經(jīng)曝氣的水族箱內(nèi)暫養(yǎng)1周。

將池蝶蚌分別分別編碼為0，6，12，24，36，48以及72 h 7組，每組3只，每只注射100 μL的10 mg·mL-1的LPS，分別于注射0，6，12，24，36，48以及72 h后收集每組個(gè)體的組織標(biāo)本。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

使用TaKaRade的RNAiso Plus提取總RNA。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，用于RACE PCR克隆HsIRAK4序列。利用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR中分析HsIRAK4的表達(dá)。本研究所用的引物均由上海生工合成，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及用途

1.3 池蝶蚌IRAK4 cDNA的克隆與序列分析

從本實(shí)驗(yàn)室以得到的池蝶蚌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲HsIRAK4基因的部分片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。分別以5′RACE-Ready cDNA為模板，用UPM通用引物分別和5′、3′端的GSP引物進(jìn)行RACE PCR。

將獲得的全長(zhǎng)序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行ORF框預(yù)測(cè)，推導(dǎo)出相信的氨基酸序列，分析相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)，并在NCBI上進(jìn)https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl行氨基酸同源比對(duì)，用ClustalX1.83和MEGA軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)1 000次。使用NetPhos服務(wù)器預(yù)測(cè)了絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。在網(wǎng)址上預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)。

1.4 LPS誘導(dǎo)下HsIRAK4與HsMyD88 mRNA表達(dá)分析

LPS誘導(dǎo)后，混合提取3只池蝶蚌各個(gè)組織(血、心、肝外、腎、閉殼肌、斧足、性腺、腸、鰓)的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA模板；根據(jù)熒光定量試劑TB Green?PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)以β-Action作為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。設(shè)置3個(gè)平行組。按照2-△△Ct方法和GraphPad Prism 8.3.0軟件的雙尾T-TEST計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建

將HsIRAK4的開(kāi)放閱讀框(ORF)和死亡結(jié)構(gòu)域(Death)分別插入到PGEX-4T-1載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF和PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death，使目標(biāo)蛋白帶上Gst標(biāo)簽蛋白。另外HsMyD88的死亡結(jié)構(gòu)域(Death)插入到Pet-32a載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Pet-32a-HsMyD88-Death，目標(biāo)蛋白帶上His標(biāo)簽蛋白。DNA測(cè)序證實(shí)了所有結(jié)構(gòu)。構(gòu)建質(zhì)粒所用引物見(jiàn)表1。

1.6 在Rosetta菌中進(jìn)行原核表達(dá)

把構(gòu)建好的PGEX-4T-1-HsIRAK4-ORF、PGEX-4T-1-HsIRAK4-Death和Pet-32a-HsMyD88-Death以及空載質(zhì)粒PGEX-4T-1、Pet-32a分別轉(zhuǎn)化到Rosetta菌。通過(guò)向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)。每隔2 h取1 mL菌液并離心收集菌體，在10%SDS-PAGE蛋白膠上跑膠鑒定蛋白誘導(dǎo)情況。

1.7 HsIRAK4與HsMyD88蛋白的純化

根據(jù)小量誘導(dǎo)的條件，進(jìn)行大量誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后收集菌體沉淀，用Binding bufferr多次吹懸，然后進(jìn)行超聲波破碎，4 ℃ 13 000 g離心，取上清；按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)簽樹(shù)脂裝柱，再將對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的蛋白上清液添加到柱子中，控制流速；上樣完畢后，加入適量的Washing buffer清洗雜蛋白，控制好流速；最后加入Elution buffer洗脫并收集目的蛋白，取10 μL收集的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白膠電泳，鑒定蛋白純化的情況。

1.8 GST-Pulldown和Western Blot(WB)

為了驗(yàn)證HsIRAK4與HsMyD88蛋白之間的相互作用，將純化好的GST標(biāo)簽蛋白和His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)。GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)簽樹(shù)脂是Gst-Beads是GE公司的GST sepharose 4B，按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。Western Blot中使用Gst抗體(Gst標(biāo)簽多克隆一抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗)檢測(cè)Gst融合蛋白是否孵育在樹(shù)脂上以及使用康為世紀(jì)公司的含HRP標(biāo)記物的抗-His標(biāo)簽的兔多克隆抗體來(lái)檢測(cè)His融合蛋白與Gst融合蛋白是否相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)設(shè)為Gst-HsIRAK4-ORF和His-HsMyD88-Death(實(shí)驗(yàn)組)、Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death(實(shí)驗(yàn)組)、Gst-HsIRAK4-ORF和His(對(duì)照組)、Gst-HsIRAK4-Death和His(對(duì)照組)、Gst和His-HsMyD88-Death(對(duì)照組)、Gst和His(對(duì)照組)6組。

2 結(jié)果

2.1 HsIRAK4基因序列的生物信息學(xué)分析

2.1.1HsIRAK4蛋白氨基酸組成分析

HsIRAK4基因的全長(zhǎng)cDNA序列為2 617 bp，5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)為146 bp，3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)為797 bp，圖1，其ORF框?yàn)? 674 bp，共編碼557個(gè)氨基酸，包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，N端的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)和一個(gè)中心激酶結(jié)構(gòu)域(KD)。經(jīng)在線軟件ExPASY推導(dǎo)出HsIRAK4基因編碼557個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為62.379 KDa，等電點(diǎn)為5.34，該蛋白顯弱酸性。在該氨基酸序列中Leu占有比最高為10.4%，Trp占有比最低為0.7%。并且該氨基酸序列含有48個(gè)磷酸位點(diǎn)，其中含有4個(gè)酪氨酸(Tyr)，13個(gè)蘇氨酸和31個(gè)絲氨酸。

2.1.2 HsLITAFs與其它物種LITAF的同源比對(duì)

氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示HsIRAK4同其他物種一樣，含有保守的死亡結(jié)構(gòu)域和中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，如圖2所示。并且無(wú)脊椎動(dòng)物的IRAK4蛋白比脊椎動(dòng)物的稍長(zhǎng)，這是由于位于DD和KD之間的額外殘基造成。

2.1.3HsIRAK4基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

我們從NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了19個(gè)物種的IRAK4的最長(zhǎng)ORF框的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)ClustalX1.83和MEGA軟件構(gòu)建的HsIRAK4基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，圖3。主要分為兩大支，無(wú)脊椎動(dòng)物和有脊椎動(dòng)物。另外，無(wú)脊椎動(dòng)物里面又分為軟體動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物。其中HsIRAK4與青蛤的同源性最高，與軟體動(dòng)物聚在一支，和魚(yú)類、靈長(zhǎng)類不在一支，說(shuō)明HsIRAK4在結(jié)構(gòu)和功能上更接近其他軟體動(dòng)物，也是IRAK家族的成員。

注：分叉處表示500次重復(fù)抽樣計(jì)算所得的置信度，標(biāo)尺長(zhǎng)度表示每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生0.1次置換;各物種白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶IRAK4序列登錄號(hào)為:Haliotis discus discus(APW79904.1);Haliotis rufescens(AGZ03661.1);Haliotis diversicolor(ADC53123.1);Cyclina sinensis(ALA99938.1);Mizuhopecten yessoensis(OWF56124.1);Crassostrea gigas(ANC27958.1);Crassostrea virginica(XP_022343079.1);Mytilus coruscus(QCO95271.1);Mytilus coruscus(AYN70022.1);Mytilus galloprovincialis(AHI17286.1);Penaeuspenicillatus(QCQ82552.1)Scylla serrata(AFZ95002.1);Oncorhynchus mykiss(CBI63173.1);Salmo salar(NP_001135238.1);Tinamus guttatus(KGL77859.1);Homo sapiens(6EG9_A);Macaca fascicularis(EHH66202.1);Macaca mulatta(NP 001129573.1)。

2.2 LPS誘導(dǎo)下各組織中HsIRAK4與HsMyD88 mRNA表達(dá)

在LPS誘導(dǎo)下，通過(guò)熒光定量檢測(cè)HsMyD88與HsIRAK4 mRNA分別在不同時(shí)間段、不同組織的表達(dá)，結(jié)果如圖4，5。

t/h

t/h

HsMyD88的mRNA結(jié)果顯示：在0 h，HsMyD88在肝胰腺的表達(dá)水平最高，為血的12.20倍，其次是性腺(8.25倍)、鰓(5.68倍)、外套膜(5.66倍)、腎(5.38倍)、腸(5.13倍)、斧足(4.61倍)、閉殼肌(1.53倍)、心臟(0.93倍)。與0相比，在6 h除閉殼肌、鰓、腎，其它組織均出現(xiàn)下調(diào)，且除心組織，其它組織均出現(xiàn)顯著性。閉殼肌、性腺和腎都在12 h出現(xiàn)一個(gè)第一個(gè)高峰，其中血和斧足均在24和48 h達(dá)到峰值。0～6 h時(shí)間段，閉殼肌出現(xiàn)輕微上調(diào)，并且在12 h達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下調(diào)，36～72 h恢復(fù)接近原來(lái)0 h的表達(dá)值。在鰓組織中，0～24 h時(shí)間段，出現(xiàn)輕微的上下調(diào)，但在36～72 h出現(xiàn)明顯的上調(diào)，并在48 h達(dá)到一個(gè)最高峰。在性腺中，12 h達(dá)到最高峰。在腎臟中，出現(xiàn)了兩個(gè)高峰，12和48 h。在外套膜中，48h達(dá)到高峰。

HsIRAK4的mRNA結(jié)果顯示：在0 h，HsIRAK4在肝胰腺的表達(dá)量最高，為血的9.10倍，其次是性腺(9.10倍)、鰓(6.74倍)、腸(5.70倍)、腎(5.41倍)、斧足(4.10倍)、心臟(3.07倍)閉殼肌(2.06倍)、外套膜(1.74倍)。在6 h，與0 h相比，除心臟，HsIRAK4在其他組織均出現(xiàn)上調(diào)；且部分組織出現(xiàn)顯著(腎、外套膜；P<0.05)和及顯著(血、腸、肝胰腺；P<0.01)。在血、閉殼肌、腸和肝組織中，出現(xiàn)6和48 h兩個(gè)峰值。斧足則一直呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。在鰓中，呈現(xiàn)6和24 h兩個(gè)峰值，并且第二個(gè)峰值高于第一個(gè)。性腺中則是先上調(diào)在12 h達(dá)到峰值，之后下調(diào)。心臟在0～36 h持續(xù)下降，在48 h上升，并且到達(dá)最高值。在腎臟中，12 h出現(xiàn)峰值。外套膜則6 h達(dá)到最高值。

2.3 HsIRAK4與HsMyD88互作

Gst-HsIRAK4-ORF預(yù)測(cè)的編碼蛋白約為88 kDa；Gst-HsIRAK4-Death預(yù)測(cè)的編碼蛋白約為38.8 kDa；His-HsMyD88-Death預(yù)測(cè)的編碼蛋白約為26 kDa。小量誘導(dǎo)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25 ℃下200 rmp·min-1誘導(dǎo)4 h下效果最佳。Gst-HsIRAK4-ORF蛋白誘導(dǎo)情況如圖6c所示；Gst-HsIRAK4-Death蛋白誘導(dǎo)情況如圖6a所示；His-HsMyD88-Death蛋白誘導(dǎo)情況如圖6b所示。純化透析的結(jié)果通過(guò)SDS-PAGE膠檢測(cè)，圖7結(jié)果顯示。Gst-HsIRAK4-ORF、Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death的蛋白以及標(biāo)簽蛋白(Gst和His蛋白)均已純化出來(lái)，Gst-HsIRAK4-Death相比其他兩種蛋白純度更高，Gst-HsIRAK4-ORF蛋白量最低，但不影響后續(xù)GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)。

GST-Pulldown的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Western Blot來(lái)檢測(cè)。即Gst-HsIRAK4-ORF、Gst-HsIRAK4-Death與His-HsMyD88-Death蛋白的相互作用通過(guò)GST-Pulldown和Western Blot實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證它們之間的相互作用關(guān)系。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，使用Gst抗體檢測(cè)Gst融合蛋白如圖8所示，在圖A、B、C中均檢測(cè)到Gst融合蛋白，這些結(jié)果說(shuō)明第一個(gè)蛋白也就是Gst融合蛋白成功吸附在了樹(shù)脂上。使用His體檢測(cè)樹(shù)脂上的第二蛋白也就是His融合蛋白。在實(shí)驗(yàn)組His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-Death、His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-ORF Gst均檢測(cè)到His融合蛋白條帶，如圖9A所示。而在其他組未檢測(cè)到第二個(gè)蛋白，圖9A和圖9B。GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)是一種用來(lái)體外檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法[11]。其原理是將探針蛋白與GST標(biāo)簽融合，融合蛋白通過(guò)GST標(biāo)簽吸附在親和樹(shù)脂上。因此，另一種蛋白能與融合蛋白發(fā)生相互作用，則能夠同時(shí)被吸附掛在樹(shù)脂上，若這兩種蛋白不能相互結(jié)合，則只有Gst融合蛋白吸附在樹(shù)脂上。綜上所述，His-HsMyD88-Death分別和Gst-HsIRAK4-Death、Gst-HsIRAK4-ORF蛋白發(fā)生了相互作用，而HsMyD88-Death蛋白并沒(méi)有和Gst標(biāo)簽蛋白發(fā)生相互作用。同時(shí)，圖9B顯示，Gst-HsIRAK4-Death蛋白、Gst-HsIRAK4-ORF蛋白、Gst標(biāo)簽蛋白均不能與His標(biāo)簽蛋白發(fā)生相互作用。因此通過(guò)這6組實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，HsMyD88的Death結(jié)構(gòu)域分別能和HsIRAK4-Death和HsIRAK4-ORF發(fā)生相互作用。

注：圖a：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導(dǎo)；“2”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導(dǎo)4 h；圖b：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導(dǎo)；“2”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導(dǎo)4 h；圖c：“1”泳道表示0 h加IPTG誘導(dǎo)；“2”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)2 h；“3”泳道表示加IPTG誘導(dǎo)4 h；“4”泳道表示未加IPTG誘導(dǎo)4 h。

注：“1”泳道表示Gst-HsIRAK4-ORF蛋白；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death；“3”泳道表示His-HsMyD88-Death蛋白；“4”泳道表示Gst蛋白；“5”泳道表示His蛋白。

注：圖A:“1”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(對(duì)照組)；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-ORF Gst和His-HsMyD88-Death(實(shí)驗(yàn)組)；“3”泳道表示input；圖B:“1”泳道表示input；“2”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death和His-HsMyD88-Death(實(shí)驗(yàn)組)；“3”泳道表示Gst-HsIRAK4-Death和His(對(duì)照組)；圖C：“1”泳道表示input；“2”泳道表示Gst和His-HsMyD88-Death(對(duì)照組)；”3“泳道表示Gst和His(對(duì)照組)。

注：圖A:“1”泳道表示input；“2”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-Death(實(shí)驗(yàn)組)；“3”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(實(shí)驗(yàn)組)；“4”泳道表示His-HsMyD88-Death和Gst(對(duì)照組)；圖B:“1”泳道表示input；“2”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-Death(對(duì)照)；“3”泳道表示His和Gst-HsIRAK4-ORF Gst(對(duì)照組)；“4”泳道表示His和Gst(對(duì)照組)。

2 討論

池蝶蚌作為無(wú)脊椎動(dòng)物，其免疫系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物相比，還不是很完善。對(duì)于抵抗病原體的入侵，僅僅依靠先天免疫系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮功能。本研究對(duì)池蝶蚌的免疫相關(guān)基因早期已經(jīng)分析揭示了多個(gè)免疫基因家族及其表達(dá)差異。然而，這種蛋白冗余的潛在基礎(chǔ)仍然不清楚。IRAK4基因作為先天免疫系統(tǒng)MyD88依賴型信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控基因，它可以引發(fā)一連串的信號(hào)事件，并最終導(dǎo)致炎癥靶基因表達(dá)的誘導(dǎo)[29]。其最初是指具有絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶活性的分子，該分子以白細(xì)胞介素1誘導(dǎo)的方式與白細(xì)胞介素受體共免疫沉淀[30]。哺乳動(dòng)物表達(dá)四種不同的IRAK分子，調(diào)節(jié)TLRs信號(hào)通路并激活下游因子[31-32]。在太平洋牡蠣中，CgIRAK4含有一個(gè)N端DD和一個(gè)C端KD，并且通過(guò)酵母雙雜交和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了CgIRAK4和CgMyD88之間的相互作用[28]。與其他物種相比，池蝶蚌HsIRAK4也含有DD和KD兩個(gè)典型的保守功能域，這有助于其作為MyD88和下游信號(hào)蛋白之間的銜接子的功能。在這種相互作用中，DD結(jié)構(gòu)域充當(dāng)了招募MyD88的媒介[33]。值得注意的是，人類IRAK4中只有R12、V16、R20、E69、T76和N78是保守的[34]。然而，在軟體動(dòng)物IRAK4中只有R12、T76和N78是保守的[28]。在人IRAK4缺陷細(xì)胞中，R12C、C13的突變破壞了IRAK4-MyD88的相互作用[35]，這表明了解IRAK4的每個(gè)氨基酸都是有意義的。同時(shí)由于無(wú)脊椎動(dòng)物DD和KD之間的額外殘基多于脊椎動(dòng)物(圖2)，可能造成無(wú)脊椎動(dòng)物IRAK4的功能有異于脊椎動(dòng)物。多重序列比對(duì)顯示這兩個(gè)功能域中的HsIRAK4蛋白序列是相對(duì)保守的，同時(shí)IRAK4基因還具有一個(gè)高度保守的賴氨酸殘基，位于ATP結(jié)合位點(diǎn)，在ATP水解過(guò)程中起關(guān)鍵作用[36]。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)我們發(fā)現(xiàn)HsIRAK4最大ORF所對(duì)應(yīng)編碼的蛋白與青蛤同源性最高，和其他軟體動(dòng)物聚在一支，遠(yuǎn)離哺乳動(dòng)物。這表明HsIRAK4在結(jié)構(gòu)和功能上更接近其他軟體動(dòng)物，也是IRAK家族的成員。

本研究結(jié)果顯示HsIRAK4在池蝶蚌中不同組織中有不同程度的表達(dá)特征。發(fā)現(xiàn)HsMyD88和HsIRAK4這兩個(gè)基因在池蝶蚌中不同組織中有不同程度的表達(dá)特征。0 h的HsMyD88在肝胰腺、性腺和鰓組織中的表達(dá)較高，其次是外套膜、腎和鰓等。這一結(jié)果李年忠[11]在0 h時(shí)間點(diǎn)HsMyD88的表達(dá)類似，都是在肝、腎、鰓等免疫組織中高度表達(dá)。MyD88在其他物種中也檢測(cè)到高度表達(dá)，如三角帆蚌的肝胰腺和鰓[37]、長(zhǎng)牡蠣的鰓和血細(xì)胞[38]、菲律賓蛤蜊的鰓[39]以及中國(guó)對(duì)蝦的血細(xì)胞[40]等。HsIRAK4在各個(gè)組織的表達(dá)與HsMyD88的表達(dá)規(guī)律基本類似，0 h在肝臟中表達(dá)最高，其次是腸、性腺、腎、鰓等。這種現(xiàn)象在其他物種中的免疫相關(guān)組織中高度表達(dá)類似，例如，石斑魚(yú)的頭部、腎臟、肝臟、鮑魚(yú)的鰓以及牡蠣的血細(xì)胞和鰓[41-43]。這些結(jié)果表明HsMyD88和HsIRAK4這兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)特征不僅存在物種間的差異還存在組織差異。這種差異性說(shuō)明HsMyD88和HsIRAK4肯在對(duì)病原體的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。在其他各個(gè)時(shí)間段點(diǎn)下，肝胰腺、腸、性腺、鰓、腎中的HsMyD88和HsIRAK4 mRNA的表達(dá)也相對(duì)較高。用LPS導(dǎo)池蝶蚌，導(dǎo)致各個(gè)組織的HsMyD88和HsIRAK4的表達(dá)上下調(diào)。金色葡萄菌誘導(dǎo)三角帆蚌2和6 h后，兩種MyD88的表達(dá)水平得到上調(diào)。用日本血吸蟲(chóng)感染釘螺，發(fā)現(xiàn)肝臟中MyD88在6，96 h的表達(dá)上調(diào)，生殖腺M(fèi)yD88在6，12，96 h的表達(dá)上調(diào)，血細(xì)胞MyD88在6，48，96 h的表達(dá)上調(diào)[44]。用LPS或PGN刺激原代血細(xì)胞培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝CfMyD88的表達(dá)水平低于對(duì)照[45]。說(shuō)明MyD88很有可能參與貝類動(dòng)物的免疫防御。在大黃魚(yú)中，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，肝臟LcIRAK4在3 h上調(diào)，血液LcIRAK4在48 h檢測(cè)到急劇上升；而經(jīng)poly I:C誘導(dǎo)后，肝臟LcIRAK4在12，24和48 h顯著下調(diào)，血液LcIRAK4則在6 h達(dá)到峰值，隨后逐漸恢復(fù)正常水平[46]。在太平洋牡蠣[28]中，經(jīng)OsHV-1 mvar、V.alginolyticus和poly I:C刺激后，血細(xì)胞中CgIRAK4的表達(dá)水平分別在6，6 h和24顯著增加，并且分別在6，24 h和24 h達(dá)到高峰；同樣在鰓組織中，經(jīng)V.alginolyticus刺激，CgIRAK4在6 h增加，12 h達(dá)到高峰，然后再48～72 h消退，而在poly I:C刺激下，CgIRAK4在24，48 h和72 h表達(dá)最高。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明IRAK4很有可能參與貝類動(dòng)物的免疫防御。MyD88依賴的Toll通路在針對(duì)革蘭氏菌的先天免疫應(yīng)答中起重要的作用，這解釋了本研究中HsMyD88和HsIRAK4基因?qū)PS誘導(dǎo)的顯著應(yīng)答反應(yīng)。因此，我們的結(jié)果表明HsMyD88和HsIRAK4參與該免疫過(guò)程。

在哺乳動(dòng)物MyD88依賴信號(hào)通路的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4通過(guò)橋接分子MAL和MyD88的共同作用下，IRAKs(IRAK1、IRAK4等)DD結(jié)構(gòu)域和MyD88的DD結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)而活化其他下游信號(hào)分子，完成信號(hào)的傳遞工作[47-49]。在池蝶蚌的研究中，已經(jīng)通過(guò)酵母雙雜交、雙分子熒光互作和GST-pulldown的實(shí)驗(yàn)證明了HsTLR4和HsMyD88能夠在酵母和SMMC-7721細(xì)胞以及體外能直接發(fā)生相互作用[11]。這一研究結(jié)果證明在淡水貝池蝶蚌的先天免疫中是存在MyD88依賴依賴信號(hào)通路。在池蝶蚌中，GST-Pulldown的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HsIRAK4在體外通過(guò)DD結(jié)構(gòu)域與HsMyD88的DD結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性的相互作用，這與太平洋牡蠣的研究結(jié)果類似。Elizabeth等人表明IRAK4可以通過(guò)磷酸化下游底物和獨(dú)立于激酶活性發(fā)生的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用傳遞信號(hào)[50]。IRAK4激酶活性在TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能在功能上是多余的，因?yàn)樵谟靡吧突蚣っ笩o(wú)活性突變蛋白重建的人IRAK4缺陷細(xì)胞中，沒(méi)有觀察到途徑被激活的實(shí)質(zhì)性差異[21,51]。因此，我們通過(guò)GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)(圖9)，發(fā)現(xiàn)在HsIRAK4在ORF框不完整只有DD結(jié)構(gòu)域的情況下也能和與HsMyD88的DD在體外結(jié)合,說(shuō)明HsMyD88可以直接和HsIRAK4的DD結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用并且這一過(guò)程不需要HsIRAK4的激酶屬性。在MyD88依賴途徑中，當(dāng)配體結(jié)合時(shí)，TLR通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域重新招募銜接分子MyD88。然后MyD88招募IRAK4并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)[52]。毫無(wú)疑問(wèn)，IRAK4在TLRs信號(hào)中起著關(guān)鍵作用。通過(guò)LPS對(duì)池蝶蚌的誘導(dǎo)分析，可以推測(cè)當(dāng)細(xì)胞受到刺激，產(chǎn)生信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，HsTLR接收信號(hào)，召集大量的銜接分子HsMyD88，再通過(guò)HsMyD88的死亡結(jié)構(gòu)域招募HsIRAK4啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。關(guān)于IRAK4是否是軟體動(dòng)物中唯一介導(dǎo)TLR/IL-1R信號(hào)的成員，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本研究為IRAK4的分子進(jìn)化提供了證據(jù)，闡明了HsMyD88和HsIRAK4對(duì)脂多糖的感染有反應(yīng)，在池蝶蚌的發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的先天免疫作用。以及證明了HsIRAK4和HsMyD88在體外直接相互作用的關(guān)系，間接說(shuō)明了HsIRAK4在池蝶蚌MyD88依賴的信號(hào)通路中具有重要的作用。然而，為了更好地理解HsIRAK4在軟體動(dòng)物先天免疫中的功能意義，繼續(xù)研究是必要的。