陳 妍，蔡文琴，陳延儒，洪麗霞，巫小丹，黃冰靜，萬 茵，劉成梅，付桂明*

(1.南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.食品學(xué)院;c.國(guó)際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330047；2.江西省樟樹貢酒業(yè)有限公司，江西 樟樹 331200)

特香型白酒是全國(guó)十二大香型白酒之一，其以整粒大米為釀造原料、新鮮谷殼為輔料，采用中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，以江西省特有的紅褚條石作為發(fā)酵容器，采用“三進(jìn)四出”的混蒸續(xù)渣發(fā)酵工藝，“四出”是指蒸餾時(shí)將發(fā)酵池內(nèi)的酒糟從上至下分為四部分進(jìn)行蒸餾，分別為面糟(一甑)、糧糟(中層，兩甑)以及底糟(一甑)。其中，底糟在蒸餾之后作為丟糟棄去，剩下三甑又繼續(xù)入池發(fā)酵，之前的面糟作為底糟入池，這就是所謂的“三進(jìn)”。由于大米與酒糟混蒸，大米中米香成分蒸餾進(jìn)入酒體中，原料經(jīng)過多次回窖發(fā)酵，不僅提高了原料的利用率，經(jīng)過多次發(fā)酵，也有利于累計(jì)風(fēng)味物質(zhì)。其具體的生產(chǎn)工藝如圖1所示[1-2]。

圖1 特香型白酒釀造工藝流程

大曲作為中國(guó)白酒生產(chǎn)的發(fā)酵劑，是白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌，霉菌和酵母菌的載體之一[3]。大曲的生產(chǎn)采用自然接種方式，其微生物主要來自原材料和空氣，并在特定自然環(huán)境中逐漸適應(yīng)，以此形成復(fù)雜且獨(dú)特的微生物群落。研究證明中國(guó)白酒的香氣特征主要是來自于大曲中微生物群落代謝活動(dòng)的結(jié)果[3-4]。而特香型白酒作為江西省特有香型的白酒，其獨(dú)特風(fēng)味的構(gòu)成與特香型白酒大曲獨(dú)一無二的制作工藝密不可分。這是因?yàn)樘叵阈桶拙拼笄谥谱鬟^程中添加了一定比例的酒糟來提高大曲的酸度，從而定向的選擇了耐酸微生物在大曲上生長(zhǎng)[5]。

酵母菌作為大曲中主要的微生物，同樣是影響白酒品質(zhì)和風(fēng)味的關(guān)鍵因素之一。大曲中的酵母菌除主要產(chǎn)乙醇的釀酒酵母外，還包含能夠產(chǎn)生大量酯酶并將糖、醛、有機(jī)酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯、醇等芳香物質(zhì)的產(chǎn)香酵母[6]。產(chǎn)香酵母主要包括假絲酵母、異常漢遜酵母和畢赤酵母等[7-8]。近年來關(guān)于產(chǎn)香酵母的研究主要集中在從不同香型白酒大曲中篩選產(chǎn)香酵母，并將其應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，從而達(dá)到提高白酒中的總酯和各類脂肪酸乙酯含量的目的，使酒體更加協(xié)調(diào)、醇厚[9-10]。如從古井貢大曲中篩選出一株高產(chǎn)乙酸乙酯的異常威克漢姆酵母，將其用于濃香型白酒釀酒生產(chǎn)可以增加白酒的香氣，并提高白酒的品質(zhì)[11]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，秋季生產(chǎn)的特香型白酒大曲中真菌含量豐富，且揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較高。因此，本文擬采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)分離純化特香型白酒秋季大曲中的酵母菌菌株，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，并結(jié)合發(fā)酵力、酯化力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析。以期為完善和提高定向調(diào)控白酒釀造技術(shù)提供更多的高發(fā)酵力和產(chǎn)酯性能優(yōu)良的酵母菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品為江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司秋季(9，10月)生產(chǎn)大曲，曲房中各隨機(jī)挑選9,10兩個(gè)月份生產(chǎn)的大曲三塊，分別粉碎后過40目篩混合，于4 ℃保藏待用。

高粱粉、麩皮為市購(gòu)；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；WLN培養(yǎng)基、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；酵母菌DNA提取試劑盒、Taq酶，天根生化科技(北京)有限公司；4-甲基-2-戊醇，上海玉博生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDX-35BI型坐式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Phenix 50-3A43L-A光學(xué)顯微鏡：鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司；PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)萃取頭：北京康林科技有限責(zé)任公司；6890N型氣相色譜質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 特香型白酒大曲中酵母菌的分離純化

1.3.2 酵母菌菌株鑒定

1.3.2.1 菌落形態(tài)觀察

被檢菌接種在WLN培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h，選取單個(gè)菌落并觀察其顏色、形狀、光滑度、濕潤(rùn)度等特征。

1.3.2.2 酵母菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

被檢菌接種在YPD斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h，呂氏美蘭染液染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2.3 酵母菌子囊孢子觀察

結(jié)合嬰幼兒配方乳粉進(jìn)口貿(mào)易的具體情況，參考前人的研究成果，本文認(rèn)為可能影響嬰幼兒配方乳粉進(jìn)口的因素主要有國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模、國(guó)內(nèi)產(chǎn)量、進(jìn)口平均價(jià)格、匯率水平以及國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品和進(jìn)口產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平等因素。

被檢菌接種在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用孔雀綠芽胞染液對(duì)其進(jìn)行染色，晾干后在油鏡下觀察子囊孢子。

1.3.2.4 酵母菌分子生物學(xué)鑒定

分別將形態(tài)學(xué)上不同的菌種活化后，液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用酵母DNA提取抽提試劑盒進(jìn)行菌株總DNA提取。利用通用引物ITS1(5’CTTggTCATTTAgAggAAgTAA3’)/ITS4(5’TCCTCCgCTTATTgATATgC3’)對(duì)酵母5.8S rDNA ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照崔小亮等[12]的方法。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心Genbank數(shù)據(jù)庫中利用Blast程序進(jìn)行核酸序列比對(duì)。

1.3.3 酵母菌發(fā)酵力、酯化力的分析

酵母菌種按2%(v/w)接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)20 d，制得麩曲樣品，參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用方法》測(cè)定酵母菌的發(fā)酵力和酯化力[13]。

1.3.4 酵母菌產(chǎn)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量分析

樣品制備：取5 g麩曲樣品加入20 mL超純水中，加1%氯化鈣固體粉末，浸泡過夜，超聲30 min后，8 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm有機(jī)膜過濾。

運(yùn)用固相微萃取聯(lián)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GCMS)對(duì)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定與分析[14]，取8.0 mL樣品，放入裝有2.0 g NaCl的頂空進(jìn)樣瓶中，內(nèi)標(biāo)為4-甲基-2-戊醇。將頂空瓶于50 ℃恒溫萃取30 min。萃取后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

氣相色譜的工作參數(shù)：氣相色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：氦氣；流速：1 mL·min-1；升溫程序：起始溫度為33 ℃，保持3 min，再以3 ℃·min-1的速率升溫到180 ℃，保持10 min，最后以6 ℃·min-1的速率升溫到230 ℃，保持20 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源：電子轟擊(EI)；檢測(cè)器電壓：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：28～500 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。采用Excel 2013、Origin 9.0和SPSS 25.0軟件進(jìn)行制圖與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌初篩結(jié)果

大曲原料經(jīng)過分離純化后初步篩選得到40株酵母菌，根據(jù)WLN培養(yǎng)基上的菌落特征可以看出，部分酵母菌差異明顯(有些菌落表面粗糙有褶皺，有些表面呈現(xiàn)淡淡的綠色，且菌落大小不一)，又通過比較菌落形態(tài)特征、顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)及有無子囊孢子形態(tài)的差異，將篩選得到的酵母菌共分為6組，(圖2和表1)。

A：菌落形態(tài)，B：細(xì)胞形態(tài)，C：子囊孢子形態(tài)(藍(lán)色)圖2 特香型白酒大曲酵母菌形態(tài)圖

表1 特香型白酒大曲中酵母菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征

2.2 酵母菌26S rRNA分子生物學(xué)鑒定

每組3株，共挑選出18株長(zhǎng)勢(shì)健壯，綜合特性良好的酵母菌株，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 酵母菌26S rRNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果

2.3 酵母菌理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

發(fā)酵力可反映酵母菌利用可發(fā)酵糖類產(chǎn)生二氧化碳和酒精的能力，酯化力可反映酵母菌催化己酸和乙醇生成己酸乙酯的能力，這兩個(gè)指標(biāo)均是評(píng)價(jià)酵母菌發(fā)酵性能是否優(yōu)良的重要指標(biāo)[15,16]。因此，本研究對(duì)篩選出的8種酵母菌進(jìn)行了發(fā)酵力和酯化力的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，SaccharomycescersvisiaeNCUF 303.1發(fā)酵力顯著高于其它酵母(P<0.05)，可達(dá)到5.22 U·g-1。產(chǎn)香酵母中PichiaanomalaNCUF 308.1、MillerozymafarinoseNCUF 307.1和CandidaglabrataNCUF 306.1的發(fā)酵力較高。而TrichosporonasahiiNCUF 301.1發(fā)酵力幾乎為0，說明該種酵母菌可發(fā)酵糖類產(chǎn)生二氧化碳和乙醇的能力是這8株酵母菌種最弱的。

酯化力結(jié)果如圖4所示，WickerhamomycesanomalusNCUF 304.1和CandidaglabrataNCUF 306.1的酯化力顯著高于其它酵母菌株(P<0.05)，分別為60.00和53.08 U·g-1。產(chǎn)香酵母酯化力的高低在一定程度上反映其產(chǎn)生香氣物質(zhì)的能力[17]。這一結(jié)果表明相比于其它產(chǎn)香酵母，W.anomalusNCUF 304.1和C.glabrataNCUF 306.1可能具有產(chǎn)生更多揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的能力，從而有效改善白酒的香氣成分。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)S.cersvisiaeNCUF 303.1酯化力較低。這可能是因?yàn)獒劸平湍冈诎拙漆勗爝^程中作用主要是產(chǎn)生酒精，故其發(fā)酵力強(qiáng)，酯化力弱[18]。

圖3 酵母菌發(fā)酵力

圖4 酵母菌酯化力

2.4 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量測(cè)定結(jié)果

采用SPME-GCMS對(duì)8株酵母菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如附表1所示。研究發(fā)現(xiàn)8株酵母菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物差別較大。其中，W.anomalusNCUF 304.1和P.anomalaNCUF 308.1固態(tài)發(fā)酵物中均檢測(cè)到揮發(fā)性物質(zhì)30種，但其具體種類不同，W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量最高，可達(dá)7.73 mg·kg-1(圖5)，這與酯化力的結(jié)果基本一致。其中，苯乙醇占W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)總含量的39.1%。苯乙醇是白酒中的重要香氣物質(zhì)，也是其他呈味化合物的前體物質(zhì)[19]。P.anomalaNCUF 308.1揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中不僅也發(fā)現(xiàn)了大量的苯乙醇，同時(shí)，也是唯一檢出產(chǎn)生乙酸乙酯的產(chǎn)香酵母。乙酸乙酯是白酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)，呈香蕉或是蘋果的水果香、有刺激感，帶澀味，可賦予白酒清香感[20]。

T.asahiiNCUF 301.1固態(tài)發(fā)酵只檢測(cè)到了18種揮發(fā)性物質(zhì)，但其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量?jī)H次于W.anomalusNCUF 304.1。其中，醛酮類物質(zhì)含量最多，這些物質(zhì)在白酒香氣方面起輔助作用，過量則會(huì)使白酒有明顯的刺激感和辛辣味[21]。C.glabrataNCUF 306.1、M.farinoseNCUF 307.1、P.kudriavzeviiNCUF 302.1和T.delbrueckiiNCUF 301.1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量也各不相同，而S.cersvisiaeNCUF 303.1固態(tài)發(fā)酵物中揮發(fā)性物質(zhì)含量很少，產(chǎn)酯能力弱。正是由于特香型白酒大曲中含有眾多種類不同的產(chǎn)香酵母，產(chǎn)生種類與含量豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，才成就了特香型白酒的獨(dú)特風(fēng)味。

圖5 不同酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量變化

3 結(jié)論

本研究首次從秋季生產(chǎn)的特香型白酒大曲中共分離鑒定出8種酵母菌，并發(fā)現(xiàn)這8株酵母菌中S.cersvisiaeNCUF 303.1發(fā)酵力最高(5.22 U·g-1)，W.anomalusNCUF 304.1酯化力(60.00 U·g-1)顯著高于其它酵母菌。并結(jié)合SPME-GCMS技術(shù)，對(duì)這8株酵母菌固態(tài)發(fā)酵下產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量測(cè)定。最終發(fā)現(xiàn)W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量最高。本研究結(jié)果可為定向調(diào)控白酒釀造中微生物結(jié)構(gòu)提供優(yōu)良的酵母菌種，為推動(dòng)特香型白酒行業(yè)規(guī)范化的發(fā)展提供理論研究基礎(chǔ)。

附表1 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類和含量

續(xù)附表1 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類和含量