吳晨，姚志浩，梅文晴，馮宇妍，陳渠，倪迎冬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點實驗室，江蘇南京210095）

B 族維生素屬于水溶性維生素，對體內(nèi)物質(zhì)代謝和健康發(fā)揮著重要作用。VB 作為飼料添加劑被廣泛用于提升動物的生長性能和產(chǎn)品品質(zhì)。早期研究表明，不同于單胃動物，反芻動物瘤胃內(nèi)存在某些微生物能夠合成B 族維生素，因此無須從飼料日糧中額外補充VB［1］。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，隨著反芻動物集約化養(yǎng)殖程度的提高，以及幼齡反芻動物瘤胃功能發(fā)育不全，適量補充B 族維生素對反芻動物健康和生產(chǎn)性能的提升具有重要意義。

動物胃腸道存在一個極其龐大且復(fù)雜的微生物群落，包含大約1014個細菌，分屬于500～1000 個物種［2］。研究資料顯示，腸道菌群與宿主新陳代謝狀態(tài)及飲食成分密切相關(guān)［3?4］，并參與組成腸道上皮屏障，保護腸道免受病原菌、毒素等的侵害［5］。因此，健康的腸道“微生態(tài)系統(tǒng)”對于維持機體健康至關(guān)重要。研究表明，添加維生素B1和B12可顯著改變5～15 周齡五龍鵝腸道的菌群豐度，增加有益菌豐度并促進腸道發(fā)育［6?7］。由于小腸上皮細胞更新較快，嚴重缺乏葉酸和維生素B12時導(dǎo)致小腸絨毛縮短和有絲分裂減少，其機制與VB 促進黏膜細胞蛋白合成、維持絨毛和黏膜的完整性有關(guān)［8］。與單胃動物一樣，反芻動物腸道微生態(tài)平衡是其健康和良好生產(chǎn)性能的前提，而反芻動物擁有更豐富的腸道微生物。有研究表明，山羊結(jié)腸和盲腸主要菌群相似，優(yōu)勢菌群主要包括厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門［9］。Jiang 等［10］發(fā)現(xiàn)不同品種山羊腸道菌群豐度亦相似，食物結(jié)構(gòu)與組成是影響腸道菌群的主要因素之一。此外，飼料添加劑、斷奶時間、生殖過程等均會影響牛腸道菌群的豐度［11］。反芻動物后段腸道菌群對飼料中纖維素和半纖維素的降解可高達30%［12］。除了消化功能，腸道微生物與宿主細胞互作，促進新生反芻動物腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育，形成第一道機體免疫屏障?黏膜免疫屏障［13］。

目前，對反芻動物微生物的研究主要集中于瘤胃微生物組成與功能上［14?15］，對腸道微生物區(qū)系的研究較少。早期研究表明，由于幼齡反芻動物瘤胃功能發(fā)育不全，需在日糧中補充維生素B1［16］，并且VB 作為一種飼料添加劑對機體代謝的影響可能與腸道微生物的改變有關(guān)［11，17］。因此，我們推測日糧中添加復(fù)合VB 對生長期山羊的生長性能具有積極作用，且可能是通過改善其腸道菌群穩(wěn)態(tài)和黏膜屏障結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的。然而，目前相關(guān)研究資料鮮有報道。本研究以4 月齡波雜山羊為研究對象，探討日糧添加復(fù)合維生素B 對生長期山羊腸道微生物組成、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸黏膜屏障功能的影響，為反芻動物養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗動物與日糧

選取10 只體重相近［（12. 60±1. 28）kg］、健康狀況良好的4 月齡波雜（波爾山羊與本地山羊雜交品種）雌山羊為試驗動物，隨機分為2 組，每組5 只。 對照組（control，CON）采食基礎(chǔ)日糧；處理組（vitamin B complex group，VB）在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合維生素B（購自河北一獸藥業(yè)有限公司）。復(fù)合維生素B 添加量參照前期的研究資料［18］，其組成及日糧中的添加劑量如下：12 mg·kg?1維生素B1，24 mg·kg?1維生素B2，24 mg·kg?1維生素B3，24 mg·kg?1維生素B5，12 mg·kg?1維生素B6和80 μg·kg?1維生素B12。

試驗用飼料購自南京青龍山飼料營銷部。精料參照4% 羊生長期復(fù)合預(yù)混合飼料（購自北京和牧同興農(nóng)牧科技有限公司）推薦配方配置。基礎(chǔ)日糧參考肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NYT816-2004）配置，精料和粗料比例為40∶60，完全滿足試驗羊營養(yǎng)需求。對照組和VB 組羊飼料僅VB 含量差異，其他成分相同。日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Dietary composition and nutrient levels

1. 2 動物飼養(yǎng)管理

本試驗于2019 年7 月4 日?10 月3 日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心進行。試驗前對羊舍全面清掃消毒，試驗期每周對圈舍進行清掃、定期消毒，確保試驗期間羊舍環(huán)境衛(wèi)生。

預(yù)飼期為2 周，試驗期為11 周，試驗羊自由采食飲水，每日于8：00 和16：00 各飼喂1 次。每周稱重，記錄采食量并計算平均日采食量。 試驗第1 周時，對照組和VB 組山羊平均日采食量分別為（502. 75±18. 50）g 和（520. 00±18. 33）g；試驗第11 周時，兩組采食量分別為（773. 00±32. 34）g 和（871. 5±15. 73）g。在1～56 d 試驗期間，兩組間干物質(zhì)平均日采食量無明顯差異，試驗第10 周時VB 組山羊平均日采食量顯著高于對照組。

1. 3 樣品采集

試驗結(jié)束，禁食一夜后進行屠宰采樣。收集近端結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物，?20 ℃保存留待微生物區(qū)系和生理參數(shù)的檢測；同時采集結(jié)腸和盲腸上皮組織樣品，留待基因和蛋白檢測；采集腸道組織樣，固定在4% 多聚甲醛中用于組織形態(tài)學(xué)分析。分子樣采集后立即置于液氮中，采樣結(jié)束后于?80 ℃保存。

1. 4 測定指標(biāo)

1. 4. 1 16S rRNA 高通量測序 采用CTAB 或SDS 方法［19?20］提取樣本的基因組DNA，隨后通過PCR 擴增和產(chǎn)物混樣純化后，使用Ion S5TMXL 進行上機測序。將得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）進行拼接過濾得到最終的有效數(shù)據(jù)（clean reads）。使用Uparse 軟件［21］以97% 的一致性將所有樣本的有效數(shù)據(jù)聚類成為OTUs（operational taxonomic units），用Mothur 方法與SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析［22］，獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平統(tǒng)計群落組成。使用MUSCLE 軟件［23］進行多序列比對，得到所有OTUs 序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進行均一化處理。

1. 4. 2 HE 染色與形態(tài)結(jié)構(gòu)測定 將4% 多聚甲醛固定的腸道組織樣品，進行乙醇脫水，石蠟包埋，制成HE 染色切片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍照?？漳c和回腸HE 切片每組5 個樣本，每張切片隨機選取6 個視野，采用Image Pro Plus 6. 0 測量每個視野內(nèi)絨毛高度和隱窩深度并計算其比值。

1. 4. 3 腸道相關(guān)基因測定 使用TRIzol（Invitrogen，美國）提取盲腸和結(jié)腸黏膜上皮組織中總RNA，實時熒光定量PCR（real-time PCR）擴增反應(yīng)檢測腸道相關(guān)基因mRNA 的表達。PCR 的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2?ΔΔCt法分析，因GAPDH基因表達量比較穩(wěn)定，選作為內(nèi)參基因。引物由北京擎科生物工程有限公司合成，引物序列信息見表2。

表2 實時熒光定量PCR 引物序列Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequences

1. 4. 4 腸道相關(guān)蛋白測定 采用Western blot方法檢測腸道相關(guān)蛋白，提取盲腸和結(jié)腸黏膜上皮組織中總蛋白，統(tǒng)一濃度后95 ℃變性處理，隨后進行SDS?PAGE 膠電泳，結(jié)束后用NC 膜轉(zhuǎn)印90 min，再用5% 脫脂奶粉封閉2 h 后一抗搖床孵育過夜，第2 天TBST 清洗3 次，加二抗搖床孵育2 h，TBST 清洗3 次，最后進行發(fā)光圖像采集，采用Im?ageJ 統(tǒng)計蛋白灰度值。

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步整理后，采用SPSS 20. 0 統(tǒng)計軟件進行T 檢驗分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，P<0. 05 表示差異顯著，P<0. 01 表示差異極顯著，0. 05

2 結(jié)果與分析

2. 1 山羊盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物微生物α 多樣性分析

如圖1 所示，稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）。

圖1 稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve（n=4）

如表3 所示，與對照組相比，VB 組山羊盲腸內(nèi)容物菌群的ACE、Chao1 和Shannon index 都有一定程度降低，但無顯著變化（P>0. 05）；結(jié)腸內(nèi)容物菌群的ACE、Chao1 和Shannon index 均無顯著變化（P>0. 05）。

表3 山羊腸道微生物α 多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of intestinal microbes in goats（n=4）

2. 2 山羊盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物菌群組間差異分析

如圖2、表4 和表5 所示為山羊腸道內(nèi)容物菌群門水平的豐度，其中盲腸中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢菌門，分別占CON 組和VB 組山羊盲腸內(nèi)容物菌群門水平的87. 21% 和88. 98%；與對照組相比，VB 組山羊盲腸中擬桿菌門的豐度有升高趨勢（0. 050. 05）。同樣山羊結(jié)腸中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門，分別占CON 組和VB 組山羊結(jié)腸內(nèi)容物菌群門水平的87. 44% 和87. 66%；與對照組相比，VB 組山羊結(jié)腸中其他菌門無顯著變化（P>0. 05）。

圖2 山羊腸道微生物門水平相對豐度Fig. 2 Relative abundance of intestinal microbes in goats at phylum level（n=4）

表4 山羊盲腸微生物門水平豐度比較Table 4 Comparison of abundance of cecal microbes in goats at phylum level（n=4）

表5 山羊結(jié)腸微生物門水平豐度比較Table 5 Comparison of abundance of colonic microbes in goats at phylum level（n=4）

如圖3 所示為山羊腸道菌群組間差異分析結(jié)果，與對照組相比，VB 組山羊盲腸中菌群目水平上Solirubrobacterales 和Streptomycetales 目菌群豐度顯著下降（P<0. 05，圖3A）；科水平上Christensenellaceae、Streptomycetaceae 和Solirubrobacteraceae 科菌群豐度顯著下降（P<0. 05，圖3B）；屬水平上Lachnoclostridium屬菌群豐度顯著升高（P<0. 05），Bacillus和Nocardioides屬菌群豐度顯著下降（P<0. 05，圖3C）。VB 組山羊結(jié)腸中菌群科水平上Christensenellaceae 科菌群豐度顯著下降（P<0. 05，圖3D）；屬水平上unidentified_Christensenellaceae和unidentified_Gammaproteobacteria屬菌群豐度顯著下降（P<0. 05，圖3E）。

圖3 山羊腸道微生物組間差異分析Fig. 3 Analysis of intestinal microbial differences in goats（n=4）

2. 3 山羊腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

如圖4 所示為山羊腸道HE 染色結(jié)果，對空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度進行測量，結(jié)果如表6 所示。與CON 組相比，VB 組山羊空腸的絨毛高度極顯著增加（P<0. 01），隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度（villus height/crypt depth，V/C）都顯著增加（P<0. 05）；回腸的隱窩深度顯著降低（P<0. 05），但絨毛高度和V/C 無顯著變化（P>0. 05）。

表6 山羊空腸和回腸組織形態(tài)的變化Table 6 Changes in morphology of jejunum and ileum in goats

圖4 山羊腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)變化Fig. 4 Intestinal epithelial morphological and structural changes in goats（400×）

2. 4 山羊盲腸和結(jié)腸相關(guān)基因和蛋白表達的變化

如圖5 所示，與CON 組相比，VB 組山羊盲腸中緊密連接和細胞增殖相關(guān)基因無顯著變化（P>0. 05，圖5A）；結(jié)腸中MIK67、CCND、Occludin基因的表達顯著上調(diào)（P<0. 05），EGFR基因的表達極顯著上調(diào)（P<0. 01，圖5B），而Claudin1 和Claudin4 基因的表達則無顯著變化（P>0. 05）。此外，結(jié)腸中ZO-1 蛋白的表達量顯著升高（P<0. 05，圖5C）。

圖5 山羊腸道上皮相關(guān)基因和蛋白表達變化Fig. 5 Changes in genes and proteins expression in intestinal epithelium of goats（n=5）

3 討論

3. 1 復(fù)合維生素B 對山羊腸道微生物的影響

腸道微生物被稱為機體的“第二基因組”，在動物生長發(fā)育和健康中扮演了重要角色。哺乳動物腸道中厚壁菌門和擬桿菌門豐度占主導(dǎo)地位，為腸道的優(yōu)勢菌群［24］。擬桿菌門細菌不僅幫助宿主分解多糖，提高營養(yǎng)利用率，還促進免疫系統(tǒng)發(fā)育，提高宿主免疫力［25?26］。保持腸道“微生態(tài)平衡”對維護動物健康和提高其生產(chǎn)性能具有重要價值［27］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合維生素B 對山羊盲腸和結(jié)腸菌群多樣性無顯著影響，但與CON 組相比，VB 組山羊盲腸中擬桿菌門的豐度有升高趨勢，盲腸中Christensenellaceae 科菌群呈下降趨勢，結(jié)腸中Christensenellaceae 科及其下屬的unidentified_Christensenellaceae屬菌群均顯著下降。Christensenellaceae 菌是一種可遺傳的腸道菌，現(xiàn)有資料表明該菌群與健康狀態(tài)有關(guān)，其豐度與宿主體重呈負相關(guān)［28?29］。本試驗結(jié)果與其相一致，VB 組山羊體重增加而腸道內(nèi)Christensenellaceae 菌減少，但此菌的具體功能有待進一步研究。

有研究報道，Lachnoclostridium菌可抑制腸道中病原體的定殖，降低結(jié)腸炎癥的危害［30?31］，且該菌群可促進短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的產(chǎn)生，對生長具有促進作用［32］。而Bacillus屬菌群通常與食物中毒和感染有關(guān)，通過產(chǎn)生某些特異性的毒素如溶血素等，從而導(dǎo)致宿主感染產(chǎn)生疾病［33］。 此外，螺旋菌門（Spirochaetes）中大多數(shù)細菌都屬于致病菌［34］。本研究結(jié)果顯示，添加復(fù)合維生素B 可顯著提高山羊盲腸中Lachnoclostridium屬菌群的豐度，顯著降低Bacillus屬菌群的豐度，且盲腸中螺旋菌門的豐度有降低趨勢，說明日糧中添加復(fù)合維生素B 可增加山羊腸道內(nèi)某些有益菌的豐度，降低有害菌的豐度，從而在一定程度上改善山羊腸道菌群的組成，使其向有益的方向發(fā)展，對提高動物腸道黏膜發(fā)育、飼料利用率和生長性能有潛在的積極作用。此外，本研究結(jié)果顯示VB 組山羊盲腸中Solirubrobacterales 和Streptomycetales 目菌群和各自對應(yīng)的科水平及Nocardioides屬菌群的豐度均顯著下降，但其在動物體內(nèi)的具體功能尚不清楚，仍需進一步的深入研究。

3. 2 復(fù)合維生素B 對山羊腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸黏膜屏障功能的影響

小腸的上皮結(jié)構(gòu)是機體營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場所，其絨毛高度和隱窩深度及其比值是衡量小腸消化吸收功能的關(guān)鍵指標(biāo)［35?36］。絨毛高度影響小腸吸收面積，其高度增加有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。絨毛高度與隱窩深度的比值則綜合反映小腸的功能狀態(tài)，其比值上升表示消化吸收能力增強。龍建華等［6］發(fā)現(xiàn)添加維生素B12可使五龍鵝的空腸絨毛高度和V/C 增加，王寶維等［7］在日糧中添加維生素B2也得到了類似結(jié)果。Sparks 等［37］的研究表明小鼠日糧缺乏維生素B1和B2會使腸道松弛，結(jié)腸張力變小，而飼喂VB1、VB2后可使結(jié)腸顯著肥大。此外，有研究發(fā)現(xiàn)維生素B2與腸上皮細胞增殖、黏膜發(fā)育密切相關(guān)［38］。以上研究結(jié)果表明，添加維生素B2對腸道絨毛發(fā)育與消化功能具有積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加復(fù)合維生素B 能夠顯著增加山羊空腸絨毛高度、隱窩深度及其比值，顯著降低回腸上皮的隱窩深度。從而表明日糧添加復(fù)合維生素B 能夠改善山羊空腸上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加上皮黏膜面積，有利于腸道的消化吸收，其中VB2可能起到主要的調(diào)控作用。

緊密連接對維持腸道屏障完整性和功能具有重要意義，通過調(diào)節(jié)其選擇通透性而保護機體免受腸道病原菌的侵害［39］。緊密連接蛋白是位于腸道上皮相鄰細胞的一種蛋白復(fù)合體，其中閉鎖小帶蛋白ZO-1 和閉鎖蛋白Occludin 是重要的骨架蛋白，對維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用［40?41］。緊密連接蛋白表達減少會使腸道緊密連接功能異常，腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)失衡［42］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合維生素B 顯著上調(diào)山羊結(jié)腸Occludin基因的表達和ZO-1 蛋白的表達。MKI67 和CCND 常作為評價細胞增殖的指標(biāo)，另一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子是內(nèi)皮生長因子受體EGFR，其激活后能夠促進細胞的增殖、分化和修復(fù)創(chuàng)傷［43］。本研究發(fā)現(xiàn)，VB 組山羊結(jié)腸MKI67、CCND和EGFR基因表達均顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明日糧中添加復(fù)合維生素B 有利于腸上皮細胞增殖與修復(fù)、改善腸道完整性與屏障功能，從而提升腸道的消化與保護功能。

4 結(jié)論

日糧中添加復(fù)合維生素B 可增加生長期山羊盲腸和結(jié)腸中有益菌的豐度并降低有害菌的豐度，促進空腸絨毛生長，上調(diào)結(jié)腸緊密連接相關(guān)基因和蛋白及細胞增殖相關(guān)基因的表達。從而改善腸道菌群組成、腸黏膜上皮完整性和屏障功能，對提升動物健康和生產(chǎn)性能具有潛在的重要意義。