楊林，龔小曼，池福敏，辜雪冬，張昊，張哲

（1.西藏農牧學院 食品科學學院，西藏林芝 860000；2.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119）

0 引言

牦牛奶是一種營養(yǎng)豐富、品質優(yōu)良的特色奶源，被稱為“天然濃縮乳”，是藏族同胞聚居地區(qū)的人們重要的食品和乳制品加工原料，奶渣、酸奶、酥油、干酪等便是其常見的加工制品，其中，奶渣是一種發(fā)酵乳制品，含有豐富的微生物資源[1-4]。常見對牦牛奶渣及其它發(fā)酵乳制品中微生物資源的研究報道，但偏向對其中優(yōu)良乳酸菌、酵母菌的篩選分離及其生理功能特性的研究。如萬金敏等人以西藏牦牛奶渣對象，對奶渣中優(yōu)勢乳酸菌的產胞外多糖及其耐受性進行了探討[5]；張曉旭則以西部牧區(qū)酸馬奶和奶渣為對象，對其中的優(yōu)勢酵母菌進行分離篩選，探討了其應用特性[6]；楊俊俊也以牦牛奶渣為對象，對其中的乳酸菌、酵母菌進行了研究、鑒定、篩選[7]；肖秋穎等則以川西高原發(fā)酵牦牛乳為對象，分離篩選降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌，并得到了降解能力極強的菌株[8]。然而，對市場銷售的各種有著地區(qū)差異的牦牛奶渣的細菌菌群多樣性還鮮有報道。

本研究以西藏林芝市場銷售的3 種不同形式的牦牛奶渣為研究對象，采用Illumina HiSeq 高通量測序檢測技術，提取牦牛奶渣中微生物宏基因組DNA，對16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)域[9]進行特異性擴增、高通量測序，研究牦牛奶渣中細菌的組成及豐度，分析牦牛奶渣中細菌群落的多樣性，以便全面認識牦牛奶渣的價值，也為進一步開發(fā)、利用西藏特色發(fā)酵乳制品中的微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 牦牛奶渣樣品的采集

本研究所采用的樣品均購自西藏林芝市巴宜區(qū)，3 組供試奶渣樣品分別來自3 個不同的市售攤點，每組樣品采用無菌包裝取樣3 份后在無菌操作環(huán)境下混勻，小心轉至無菌離心管中，按照要求分別編號為M01、M02、M03后置于冰箱（-20 ℃）中保存[10]。

圖1 3種市售奶渣外觀圖

1.2 主要實驗試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒，Life 公司；2×Taq Master Mix，Vazyme 公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，Transgen公司。

1.3 實驗設備

Pico-21 型臺式離心機，Thermo Fisher 公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，美國UVP 公司；Q32866Qubit?3.0 熒光計，Invitro?gen公司；T100TM Thermal Cyeler PCR儀，BIO-RAD公司；Research plus 0.5～10μL移液器，Eppendorf公司。

1.4 實驗方法

所有奶渣樣品進行DNA 提取和高通量測序。

1.4.1 DNA 提取及純度鑒定

參照OMEG 公司的E.Z.N.ATMMag-Bind 土壤基因組提取試劑盒提取奶渣樣品中DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對抽提后的基因組DNA 進行檢測。

1.4.2 16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)域特異性擴增及高通量測序

使用Qubit 2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量供試奶渣樣品DNA，以純化的DNA 為模板，采用通用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GAC?TACHVGGGTATCTAATCC）擴增目的片段16S rD?NA V3～V4區(qū)。

PCR 擴增反應體系：5 μL10× PCR buffer，0.1 mmol/LdNTP，10 ngGenomic DNA，0.5 μmol/L341F，0.5 μmol/L805R，0.05U Plantium Taq，ddH2O 補充至50 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5 個循環(huán)；然后再94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產物進行瓊脂糖電泳后，使用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒回收DNA。再使用Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒精確定量回收的DNA，1∶1 的等量混合后，利用Illumina HiSeq 平臺進行測序。

重大突破出現了：他的團隊在一個極小的模糊熱團塊中探測到了熱斑（或者說“耀斑”）存在的證據，這直接標明了那個疑似黑洞天體的位置。一個重達400萬個太陽質量的黑洞應該有一張“嘴”（或者說“視界”），其直徑大約是1 600萬英里 ——實在是太小了，小到地球上的“引力”干涉儀都無法將其分辨出來。

1.4.3 生物信息學分析

使用QIIME（version1.8.0）軟件中的UCLUST 對Tags 在相似度為97%水平下聚類、獲得OTU[11]。根據OTU 的序列組成得到種屬地位，并進行分類學分析，同時利用Alpha 多樣性指數分析、Beta 多樣性指數分析等評價微生物群落的豐度和多樣性，挖掘樣品間的差異。

2 結果及分析

2.1 OTU 聚類分析

3 個樣品測序共產生238 280 對Reeds，對其進行雙端Reeds拼接、過濾后，每個樣品至少產生42 912 條Clean tags，平均產生74 702 條Clean tags，進一步將得到的優(yōu)化序列聚類，劃分OTU 數。樣本間OTU 數組成的相似性及其重疊情況見圖2。由圖可知，樣品M01 中OTU 總數目為190，其中獨有的OTU 數為6；樣品M02 中OTU 總數為81，其中獨有的OTU 數為3；樣品M03 中OTU 總數為226，其中獨有的OTU 數為37，M01 和M02、M01 和M03、M02 和M03 分別共有的OTU 數為73、184、78，3 組樣品中共有的OTU 數為73。經過分析，樣品M03 中細菌的種類比另外兩種更豐富，且樣品M03與樣品M01中共有微生物數目較多。聚類的OTU 數表現出一定的差異性，在數量上表現為樣品M03>樣品M01>樣品M02。

圖2 3種市售奶渣OTU Venn圖

2.2 Alpha多樣性指數分析

3種市售奶渣的物種多樣性指數見表1和圖3。

表1 Alpha多樣性指數統計

樣本在不同測序數量時的生物物種信息見圖3a。由圖3a 可知，其斜率在0～10 000 的測序數量范圍內逐漸上升，后趨勢平緩，進入平臺期，說明測序量再增加，而OTU 種類不會再隨著增長，表明樣品中絕大多數的微生物信息在使用研究中的測序數據量情況下已經能夠被充分反映。

圖3 3種市售奶渣物種信息圖

驗證測序數據量反映樣品物種多樣性結果見圖3b。從圖中可發(fā)現，當測序范圍在0～20 000，曲線隨著測序條數增加出現了急劇上升的趨勢，這表明有大量物種在群落中被發(fā)現。從各樣品該曲線的斜率來看，M03>M01>M02，說明各物種的多樣性為M03＞M01＞M02。隨著測序數量的進一步增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，但未進入平臺期，說明再增加測序數量也只會產生少量新的OTUs。結合表1 種牦牛奶渣樣品M01、M02、M03 在Alpha 多樣性分析中的Simp?son 指數結果0.1985、0.8475、0.036，Chao1 指數213、108、226，Coverage 指數0.9997、0.9993、1.0，表明測序數據量合理，可以反映樣品中絕大多數的微生物信息。

不同物種的分布規(guī)律見圖3c。由圖3c 可知，M01 樣品的曲線比其他樣品的曲線更平坦且在橫坐標上長度越寬，說明M03 中的微生物組成更豐富、分布更均一，其次是M01、M02。

2.3 物種注釋及分類學分析

表2 樣品各等級Tags統計表

表3 樣品各等級物種統計表

由表2 可知，在門、科、屬水平上，M01、M02、M03物種tags 數均分別為83731、2694、83299。由表3 可知，在門水平上，物種組成分析共獲得15 個門，在科水平上，物種組成分析共獲得89 個科，在屬水平上，物種組成分析共獲得156 個屬。其中樣品M01、樣品M03物種類型豐富且相似，樣品M02物種較少。

3 種不同牦牛奶渣樣品中不同門水平下物種分布見圖4。由圖4a 可知，樣品M01 中厚壁菌門（Fir?micutes）豐度最大，占細菌群落52.47%；其次是變形桿菌門（Proteobacteria），為38.38%，未識別的菌群占比6.87%，其他檢測出來的菌種含量極低。樣品M02 中變形桿菌門（Proteobacteria）為可檢測出來菌群中豐度最大的菌種，占比5.38%；厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）含量極低，檢測出未識別的菌群占比93.3%。樣品M03 中，變形菌門Proteobacteria 為其優(yōu)勢菌種，細菌含量占比55.91%，其次是厚壁菌門（Firmicutes），占比26.74%。M03 樣品可檢測出的菌種相較另外兩種而言，含量與種類均更豐富多樣。

牦牛奶渣樣品中細菌群落在科分類水平的分布情況見圖4b。由圖4b 可知，樣品M01 中乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，在細菌群落中占比49.18%，為其優(yōu)勢菌種，其次是醋菌科（Acetobactera?ceae），占比27.12%，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）占比分別為2.11%、2.33%，檢測出未識別的菌群占比6.87%，Others 菌群占比5.7%。樣品M02 中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）有一定豐度，占比3.12%，為其優(yōu)勢菌種，Others 菌群占比0.88%，但其檢出卻未識別的菌群占比最大，為93.30%。樣品M03 中，細菌群落豐富且均有一定豐度，其中，乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，在細菌群落中占比13.42%，其次為假單胞菌科（Pseudo?monadaceae），占比10.00%，所檢出的其他微生物均有一定豐度，為2.76%～8.47%，除此之外，Others 菌群占比26.24%，遠遠超出M01、M02 樣品，檢測出未識別的菌群僅有0.57%，少于M01、M02樣品。

牦牛奶渣樣品中細菌群落在屬分類水平的分布情況見圖4c。由圖4c 可知，樣品M01 中乳酸菌屬（Lactobacillus）豐度最高，細菌群落占比49.18%，其次是醋酸桿菌屬（Acetobacter）占比27.12%，Others 菌群占比9.85%，檢測出未識別的菌群占比6.87%。樣品M02 中所檢測出來的微生物豐度極小，占比0.03%～0.99%；M02 中Others 菌群占比3.70%，檢測出未識別的菌群占比極大，為93.30%。樣品M03 中，乳酸菌屬（Lactoba?cillus）豐度最大，為13.42%，其次為假單胞菌屬（Pseudo?monas），占比10.00%，所檢測出來的其他微生物有一定豐度，為2.70%～8.02%，Others 菌群占比極大，為34.27%，檢測出未識別的菌群占比較低，為0.57%。其變化規(guī)律與科分類水平相似。

圖4 不同水平下物種分布柱狀圖

綜上所述，在門水平上，3 種牦牛奶渣中樣品M01中厚壁菌門（Firmicutes）豐度最大，其次是變形桿菌門（Proteobacteria），樣品M02、M03 中變形桿菌門（Pro?teobacteria）為優(yōu)勢菌種；在科水平上，樣品M01、M03中乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）豐度最大，樣品M02中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為其優(yōu)勢菌種。在屬水平上，樣品M01、M03 中優(yōu)勢菌群都是乳酸菌屬（Lactobacillus），與萬金敏[12]、南志強[13]、劉潔潔[14]等眾多研究發(fā)酵乳制品中優(yōu)勢菌群的學者的研究結果一致，但樣品M02 中無顯著的優(yōu)勢菌群。三水平下的細菌群落分布均說明M03 樣品可檢測出的菌種相較另外兩種而言，含量與種類均更豐富多樣，而樣品M02 中極大部分微生物是檢出未識別狀態(tài)。分析由于其自然環(huán)境、地理位置的不同，各個地區(qū)制備傳統發(fā)酵乳制品所采用的牦牛奶、加工工藝等方面也存在差異[15]。因此，造成不同地區(qū)牦牛奶渣制品中微生物結構、物種組成與含量存在一定差異。

3 結論

本研究采用高通量測序法，對林芝市售3 種牦牛奶渣中的細菌多樣性進行分析，共獲得有效序列224 106 條，OTU 數為235；對不同市售牦牛奶渣產品中細菌群落組成的分析發(fā)現，牦牛奶渣樣品中細菌門有15 種，厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteo?bacteria）豐度最高；細菌科有89 種，乳酸桿菌科（Lac?tobacillaceae）的豐度最高；細菌屬有156 種，乳酸菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）為優(yōu)勢菌屬。另外，細菌群落豐富度和多樣性高低、分布均勻性上來說，M03樣品＞M01樣品＞M02樣品。