吳崢嶸，李淵，郝素英

北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078

膿毒癥是指機(jī)體對感染導(dǎo)致的宿主免疫功能失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙[1-2]，對人類健康造成了巨大威脅，已成為全球范圍內(nèi)危重患者死亡的主要病因[3]。研究表明，免疫抑制是膿毒癥晚期最重要的變化，膿毒癥患者因免疫功能低下導(dǎo)致反復(fù)出現(xiàn)全身性嚴(yán)重感染[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膿毒癥的病機(jī)為邪毒內(nèi)陷、正氣無力、抗邪之氣微陽脫、臟腑衰弱所致的氣機(jī)逆亂。參附注射液由人參、附子組成，具有益氣扶正、補(bǔ)氣通陽的功效[5]。研究表明，參附注射液可以通過調(diào)節(jié)膿毒癥患者的免疫功能，維持免疫和炎癥之間的平衡，從而改善臨床癥狀[6-7]。研究顯示，T淋巴細(xì)胞凋亡與膿毒癥后期的免疫抑制關(guān)系密切[8]。阻斷淋巴細(xì)胞凋亡能明顯延長膿毒癥小鼠的生存期[9]。在調(diào)控T淋巴細(xì)胞分化中Notch信號通路發(fā)揮重要的作用，抑制Notch信號通路能提高膿毒癥小鼠的抗感染能力[10-12]。參附注射液對膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚未報(bào)道，本研究基于Notch信號通路探討參附注射液對膿毒癥的免疫調(diào)控作用，為臨床提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 動物SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量28～30 g，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。依照本院實(shí)驗(yàn)動物管理辦法，室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究中所有動物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：2019-032。

1.2 藥物與試劑參附注射液(雅安三九藥業(yè)公司，批號：01811201)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10酶聯(lián)免疫測定試劑盒(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)(南京建成生物有限公司，批號：NJ1256、NJ60082、NJ00283)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：G112015)；原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL)試劑盒(美國Trevigen公司，批號：TR25658)；兔抗小鼠Notch1單抗和羊抗小鼠Hes1單抗(美國Invitrogen公司，批號：46-2500、46-1589)。

1.3 儀器LIOOS600T型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；GelDoc Go型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；RM2135型組織切片機(jī)(德國Leica公司)；20PR-52D型高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi公司)；FACS420型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 動物模型構(gòu)建和分組處理小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，每組10只，即假手術(shù)組、模型組、參附注射液低劑量組(5 mL·kg-1)、參附注射液高劑量組(10 mL·kg-1)。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)制備膿毒癥模型[13]：術(shù)前12 h禁食，10%異氟烷腹腔注射將小鼠麻醉后，取仰臥位固定在無菌操作臺上，于腹正中行縱切口2 cm，牽出盲腸，使用4號線結(jié)扎盲腸根部，同時(shí)使用14G套管針將盲腸貫通穿孔，輕微用力擠出少許大便，確保穿刺空的通暢，使腸管回腹腔，逐層縫合傷口。假手術(shù)組小鼠僅暴露盲腸后即進(jìn)行傷口縫合，其他操作同上。造模后2 h各組給予相應(yīng)的藥物，每12 h腹腔注射1次，連續(xù)4次，假手術(shù)組和模型組注射同體積生理鹽水。

2.2 ELISIA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平采用摘除眼球法收集各組小鼠外周血后，離心，取血清，ELISIA試劑盒檢測小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.3 計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)取血后，將小鼠以頸椎脫臼法處死，在顯微鏡下準(zhǔn)確剝離小鼠脾臟，稱取質(zhì)量，計(jì)算小鼠的脾臟指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 HE染色檢測各組小鼠脾臟組織病理學(xué)改變每組隨機(jī)選擇3只小鼠，取脾臟，置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，按HE染色步驟制作切片，光鏡下觀察小鼠脾臟病理改變。

2.5 TUNEL染色檢測各組小鼠脾臟細(xì)胞凋亡取上述HE染色的蠟塊，二甲苯浸洗兩次，梯度乙醇浸洗5 min，風(fēng)干后用3%雙氧水-甲醇浸泡 10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4 ℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應(yīng)混合液，加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h，37 ℃ PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡觀察小鼠脾臟的細(xì)胞凋亡情況。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟組織中Treg、Th17淋巴細(xì)胞的百分比將每組小鼠靜脈血1 mL放入EDTA抗凝管中，加入抗體(FITC抗人IL-17 mAbIgG、FITC 抗人CD25mAb)10 μL，室溫下避光孵育30 min，然后加入200 μL溶血素避光放置 15 min，裂解紅細(xì)胞，3 000 r·min-1離心5 min，用PBS重懸后再離心，洗滌2次，沉淀用100 μL 10 ng·L-1多聚甲醛溶液固定，流式細(xì)胞儀檢測Treg、Th17細(xì)胞百分比。

2.7 Western blot檢測各組小鼠脾臟組織中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)每組隨機(jī)選擇3只小鼠，取脾臟，提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度后，變性，取50 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將樣品蛋白轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)膜上，脫脂奶粉封閉后，一抗(11 500)稀釋后，4 ℃ 孵育過夜，洗滌加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗孵育3 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ELC顯色30 min，經(jīng)曝光、顯影、定影后，以GAPDH為內(nèi)參來表示蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 參附注射液對小鼠脾臟指數(shù)的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖1。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖1 各組小鼠脾臟指數(shù)的比較

3.2 參附注射液對小鼠脾臟組織病理學(xué)改變的影響假手術(shù)組小鼠脾臟表面有光澤，結(jié)構(gòu)完整，紅髓、白髓界限清晰，脾小體形態(tài)和數(shù)量正常，脾小結(jié)性狀正常，淋巴細(xì)胞未見有明顯的分化分裂現(xiàn)象，細(xì)胞分布致密；模型組小鼠脾臟腫脹明顯，體積變大，脾臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，紅髓、白髓分界不清，紅髓縮小，白髓區(qū)域擴(kuò)張，濾泡增加，結(jié)締組織增加，脾小體數(shù)量明顯減少，脾小結(jié)不同程度腫脹，淋巴細(xì)胞排列稀疏；參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟可見清晰的白髓、紅髓以及邊緣區(qū)，脾小體數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量有所增加，脾臟病理變化均有所改善，且高劑量組改善更明顯。見圖2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組：C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組圖2 觀察各組小鼠的脾臟組織病理損傷改變(HE染色，×200)

3.3 參附注射液對小鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖3。

3.4 參附注射液對小鼠脾臟Th17、Treg淋巴百分比的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟Th17淋巴細(xì)胞百分比顯著升高，Treg淋巴細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟Th17淋巴細(xì)胞百分比顯著降低，Treg淋巴細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯，說明參附注射液可明顯改善膿毒癥小鼠Th17、Treg淋巴細(xì)胞百分比，維持免疫調(diào)節(jié)功能的平衡。見圖4。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖3 TUNEL染色檢測小鼠脾臟組織中細(xì)胞的凋亡(×400)

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：參附注射液低劑量組；D：參附注射液高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 各組小鼠脾臟Th17、Treg淋巴細(xì)胞百分比

3.5 參附注射液對小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清中IL-17、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠血清IL-17、TNF-α水平顯著下降，IL-10水平顯著升高(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖5。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 檢測各組小鼠血清中IL-17、IL-10和TNF-α水平

3.6 參附注射液對小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟Notch1、Hes1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且高劑量組變化更明顯。見圖6。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖6 Western blot檢測各組小鼠胸脾臟組織中Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)

4 討論

膿毒癥是一種與免疫抑制緊密相關(guān)的危及生命的器官功能障礙綜合癥。該病常見于外科術(shù)后、創(chuàng)傷以及免疫低下等，細(xì)菌引起的全身性嚴(yán)重感染，如不能有效的控制感染，可進(jìn)一步演變?yōu)槟摱景Y休克或多器官衰竭綜合癥，導(dǎo)致患者失去生命[14-15]。膿毒癥臨床發(fā)病多以虛實(shí)夾雜或虛證為主，邪氣耗氣傷陰，失治誤治又犯“虛虛實(shí)實(shí)”之弊?？股乜嗪鶄柣蚣又仃柼撝畡?，甚者形成虛陽外越、陽氣欲脫之勢[16-18]。參附注射液是根據(jù)中醫(yī)古方參附湯演化而來，參附湯是益氣溫陽、扶正固本的代表方，且在臨床應(yīng)用取得了良好的效果。有學(xué)者認(rèn)為，膿毒癥誘發(fā)的免疫抑制甚或免疫麻痹狀態(tài)所產(chǎn)生的反應(yīng)即是機(jī)體處于正虛無力抗邪的急性虛證狀態(tài)，此期主要的病機(jī)為“邪毒熾盛，正氣已虛”[19]。

免疫系統(tǒng)是包括器官、組織、細(xì)胞和效應(yīng)分子的綜合復(fù)雜系統(tǒng)，其中脾臟是關(guān)鍵的外周免疫器官，也是機(jī)體最大的淋巴器官，免疫器官的臟器指數(shù)是衡量免疫系統(tǒng)臟器是否受損的初步指標(biāo)[20]。本研究中模型組小鼠脾臟指數(shù)顯著低于假手術(shù)組，經(jīng)過參附注射液治療后，脾臟指數(shù)顯著升高，說明參附注射液能夠修復(fù)免疫系統(tǒng)臟器損傷。研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液能夠調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠的免疫系統(tǒng)，抑制炎性反應(yīng)，減輕器官損傷[21]。T細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，主要介導(dǎo)機(jī)體對寄生病原體以及腫瘤細(xì)胞的清除[22]。研究表明，膿毒癥應(yīng)激過程中脾臟可受到不同程度的損傷，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能受限，出現(xiàn)免疫抑制[23]。Th17和Treg細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞群，二者在生理功能上相互制約，共同參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[24]。當(dāng)機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，T細(xì)胞趨于向Treg細(xì)胞方向分化；當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染時(shí)，免疫系統(tǒng)被激活，T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，發(fā)生自身免疫性疾病[24]。Treg細(xì)胞與其他CD4+T細(xì)胞不同，是一類具有抑制炎癥反應(yīng)作用的細(xì)胞，可提高外周血Treg淋巴細(xì)胞的水平、減輕腎損傷[25]。嚴(yán)重膿毒癥患者使用參附注射液后，能明顯改善T細(xì)胞亞群，有助于維持免疫炎癥調(diào)節(jié)功能的平衡[26]。

Th17/TregT細(xì)胞亞群對機(jī)體起免疫平衡調(diào)節(jié)作用，通過分泌IL-17、TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子，抑制巨噬細(xì)胞、Th細(xì)胞釋放促炎因子，從而抑制炎癥反應(yīng)[27]。本研究中模型組小鼠脾臟IL-10水平及Treg細(xì)胞百分比均顯著低于假手術(shù)組，而 IL-17、TNF-α及Th17細(xì)胞百分比明顯高于假手術(shù)組，提示膿毒癥加劇了Th17和Treg細(xì)胞平衡向Th17轉(zhuǎn)化，參與全身炎癥反應(yīng)，而參附注射液可能通過恢復(fù)膿毒癥小鼠脾臟Th17/TregT細(xì)胞亞群介導(dǎo)的免疫平衡，達(dá)到治療的目的。

Notch信號通路是T細(xì)胞分化、增殖和活化的重要通路，在多種免疫疾病中發(fā)揮重要作用。在成熟的免疫細(xì)胞表面均有Notch受體的表達(dá)，Notch是一種單次跨膜受體蛋白，通過細(xì)胞間相互作用可活化下游靶基因hes，影響T細(xì)胞的生理功能，特別是在Th17/Treg細(xì)胞分化中作用最為顯著[28]。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎小鼠Th17細(xì)胞百分比及Th17/Treg明顯升高，同時(shí)Notch蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[29-31]。本研究結(jié)果顯示，參附注射液低、高劑量組小鼠脾臟組織中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明參附注射液可能通過Notch信號通路調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫平衡參與膿毒癥的進(jìn)展。

綜上所述，參附注射液可以減輕膿毒癥模型小鼠脾臟功能損傷，可能是通過Notch信號通路調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫平衡，從而改善膿毒癥的免疫抑制。