嚴(yán)仕夢，閆少慶，楊曉，王麗翔，柳國斌

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021

糖尿病周圍血管疾病(diabetic peripheral vascular disease，DPVD)是糖尿病患者在長期病程中發(fā)生的以下肢為主的外周大、中、小動(dòng)脈血管粥樣病變?yōu)橹鞯穆圆l(fā)癥，臨床表現(xiàn)為下肢皮膚干燥，肢體感覺發(fā)涼麻木、酸脹感、出現(xiàn)靜息痛、間歇性跛行等臨床癥狀，病程后期可出現(xiàn)干性壞疽[1]。糖尿病患者受高血糖影響，出現(xiàn)一系列血管硬化、增厚、彈性下降等周圍血管病變，是患者非外傷致殘的主要原因之一[2]。目前治療糖尿病周圍神經(jīng)血管病變主要從控制血糖、改善微循環(huán)等方面入手，但總體療效欠佳。在治療DPVD方面，中西醫(yī)結(jié)合治療效果更佳，且不良反應(yīng)少[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病以虛為本，瘀為標(biāo)，通過對DPVD中醫(yī)用藥規(guī)律進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)其中黃芪在補(bǔ)氣治療應(yīng)用中占據(jù)首位，黃芪是中醫(yī)學(xué)治療DPVD的關(guān)鍵組分[4]。

黃芪，多年生草本植物，為豆科植物蒙古黃芪的干燥根，藥用歷史悠久，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有固表止汗、生津養(yǎng)血等功效[5]。古代常稱黃芪為“黃耆”，指的就是黃芪為補(bǔ)氣之長，補(bǔ)氣之要藥?，F(xiàn)代研究表明，黃芪能夠增強(qiáng)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力和應(yīng)急能力，促進(jìn)機(jī)體代謝等功能[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的一種強(qiáng)大藥物作用分析工具，將藥物網(wǎng)絡(luò)與生物結(jié)合，為藥物療效的深入機(jī)制分析提供證據(jù)，在研究中醫(yī)藥療效方面發(fā)揮著重要作用，為傳統(tǒng)中藥在分子微觀水平探討多重藥理機(jī)制提供了諸多可能[7]。分子對接Autodock Vina 采用的是半柔性對接的方式，受體為剛性，只改變小分子配體，根據(jù)拉馬克遺傳算法在格點(diǎn)盒子中依次計(jì)算格點(diǎn)能，尋找結(jié)合能最低的結(jié)構(gòu)象，具有花費(fèi)時(shí)間少、效率高、精度佳的特點(diǎn)。目前黃芪治療DPVD的研究仍較少，機(jī)制研究匱乏。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探索黃芪治療DPVD的有效成分和作用靶點(diǎn)，篩選關(guān)鍵組分，為研究黃芪治療DPVD進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選黃芪的有效化學(xué)成分和治療疾病靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索藥物黃芪，得到成分87個(gè)。通過口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18對有效成分進(jìn)行篩選[8]，得到黃芪有效成分20個(gè)。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜尋黃芪有效化學(xué)成分中的每個(gè)靶點(diǎn)的信息，通過Perl數(shù)據(jù)包結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)對得到的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。以關(guān)鍵詞 “Diabetic Peripheral Vascular Disease”在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點(diǎn)基因并進(jìn)行合并去除重復(fù)值，然后對規(guī)范化后的藥物靶點(diǎn)基因和GeneCards、OMIM中篩選得到的疾病靶點(diǎn)基因取交集，得到藥物-靶點(diǎn)基因韋恩圖。

1.2 疾病-藥物-主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化將黃芪-DPVD的共同靶點(diǎn)基因和黃芪治療疾病主要成分相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape (3.7.2)進(jìn)行處理，順序?qū)爰膊?、藥物分子網(wǎng)絡(luò)信息和節(jié)點(diǎn)類型，呈現(xiàn)疾病-藥物-關(guān)鍵化學(xué)分子-疾病靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心作用靶點(diǎn)篩選進(jìn)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)，選擇人源物種，導(dǎo)入黃芪-DPVD的交集基因，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將蛋白關(guān)系評分設(shè)為高級別0.7，隱藏游離蛋白，黃色連線表示文本挖掘證據(jù)，藍(lán)色連線表示基因共進(jìn)化證據(jù)，紅色連線表示基因融合證據(jù)等，下載PNG格式PPI蛋白互作圖，保存PPI互作TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape，運(yùn)用MCODE插件分析核心作用靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG富集分析通過Perl語言數(shù)據(jù)包轉(zhuǎn)換交集基因名稱為基因ID。安裝R語言數(shù)據(jù)包，設(shè)置pvalue<0.05，qvalue<0.05對基因ID進(jìn)行GO和KEGG富集分析，輸出結(jié)果繪制barplot柱狀圖[9]。

1.5 分子對接驗(yàn)證在TCMSP網(wǎng)站下載黃芪治療DPVD主要藥物成分的mol2結(jié)構(gòu)式，運(yùn)用AutoDock tools(1.5.6)進(jìn)行處理，通過加氫，計(jì)算電荷數(shù)目，合并非極性氫后保存為pdbqt格式。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)下載PDB格式的核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，運(yùn)用AutoDock tools(1.5.6)進(jìn)行同樣的處理，根據(jù)每個(gè)受體蛋白結(jié)構(gòu)的不同，定義不同的Grid Box盒子。運(yùn)用Autodock Vina(1.1.2)進(jìn)行藥物配體和靶點(diǎn)蛋白的對接，選取每個(gè)藥物配體結(jié)合能最低的結(jié)合能。計(jì)算黃芪主要成分中每個(gè)成分與10個(gè)核心靶點(diǎn)的平均結(jié)合能，取絕對值，繪制平均結(jié)合能絕對值條形圖，將得到的受體配體復(fù)合體導(dǎo)入Discovery Studio (3.5)客戶端轉(zhuǎn)換pdb格式，然后導(dǎo)入Pymol 軟件(1.7)，導(dǎo)出圖片格式。

2 結(jié)果

2.1 黃芪有效成分篩選通過查詢TCMSP平臺獲得黃芪成分列表，經(jīng)過生物利用度OB，藥物相似性DL篩選出20種有效成分。

2.2 預(yù)測藥物-疾病靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫逐個(gè)查詢黃芪有效成分，匯總所有靶點(diǎn)，運(yùn)用Perl語言包進(jìn)行基因名稱注釋標(biāo)準(zhǔn)化。在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索DPVD的靶基因，共獲得靶點(diǎn) 7 469 個(gè)。通過R包對黃芪靶點(diǎn)和DPVD的靶點(diǎn)繪制韋恩圖(見圖1)，篩選出98個(gè)交集靶點(diǎn)，可能是黃芪治療DPVD的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 黃芪與DPVD靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 疾病-藥物-關(guān)鍵藥物分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過Cytoscape 軟件對疾病-藥物-關(guān)鍵藥物分子-靶點(diǎn)可視化處理，記錄疾病藥物共同靶點(diǎn)所對應(yīng)的化合物，最終得到黃芪-DPVD的關(guān)鍵化學(xué)成分16個(gè)，見表1。根據(jù)節(jié)點(diǎn)屬性及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)可視化圖，見圖2。

表1 黃芪作用DPVD主要成分

圖2 黃芪與DPVD網(wǎng)絡(luò)可視化圖

2.4 蛋白質(zhì)互作核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將98個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖，見圖3。其中評分≥0.997的互作蛋白為VEGFA-KDR、NOCOA2-AR、MAPK8-JUN、KDR-VEGFA、F7-F3、EGRF-EGF、PPARG-NCOA2、PPARG NCOA1、RXRA-PPARG、NCOA2-RXRA、NCOA1-ESR1、NCOA1-RXRA。這些蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用，可信度高。將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape，運(yùn)用MCODE插件分析核心基因，分別為EGF、CCL2、VEGFA、MAPK8、IL-6、PPARG、JUN、MMP2、MMP1、IL-1B，見圖4。

圖3 黃芪靶標(biāo)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果通過富集分析，篩選出前20條GO生物學(xué)過程，排名靠前的生物學(xué)過程包括肽結(jié)合活性，酰胺結(jié)合活性，絲氨酸水解酶活性，內(nèi)肽酶活性，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性，神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，絲氨酸型內(nèi)肽酶活性，絲氨酸型肽酶活性，核受體活性轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合氧化還原酶活性等，見圖5。通過富集分析，篩選前20條KEGG相關(guān)信號通路，包括流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路，糖尿病并發(fā)癥糖基化及糖基化受體信號通路，IL-17信號通路，TH17細(xì)胞分化通路，雌激素信號通路，TNF信號通路，內(nèi)分泌抵抗通路，表皮生長因子酪氨酸激酶抑制抵抗信號通路等，見圖6。黃芪可以通過眾多生物學(xué)調(diào)控發(fā)揮治療DPVD的作用。

圖5 黃芪靶標(biāo)GO富集分析

圖6 黃芪靶標(biāo)KEGG富集分析

2.6 分子對接驗(yàn)證通過運(yùn)用AutoDock Vina對核心靶點(diǎn)基因和黃芪主要成分依次對接，計(jì)算每個(gè)基因和黃芪每個(gè)成分的最低結(jié)合能，運(yùn)用R包繪制黃芪成分與核心靶點(diǎn)的熱圖，見圖7。分子對接中，結(jié)合能的絕對值越大，則化合物越能與靶點(diǎn)更好地結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定的構(gòu)象。當(dāng)結(jié)合能>5.0時(shí)，提示化合物與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能>7.0時(shí)，具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[10]。黃芪主要成分與核心靶點(diǎn)大部分能產(chǎn)生較好的結(jié)合能，部分結(jié)合能達(dá)到了-10 kJ·mol-1，其中黃芪異黃烷苷(MOL000379)、白樺脂酸(MOL000211)、葉酸(MOL000433)平均結(jié)合能均>7，提示與核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能，見圖8。選取3種成分與靶點(diǎn)最高結(jié)合能進(jìn)行卡通結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，黃芪異黃烷苷與JUN和VEGFA(結(jié)合能-8.8 kJ·mol-1)，白樺脂酸與VEGFA(結(jié)合能-9.1 kJ·mol-1)，葉酸與JUN(結(jié)合能-9.1 kJ·mol-1)，呈現(xiàn)二維結(jié)構(gòu)圖，見圖9。

圖7 黃芪主要成分與靶標(biāo)的分子對接熱圖

圖8 黃芪主要成分平均結(jié)合能絕對值圖

注：A：黃芪異黃烷苷與VEGFA蛋白結(jié)合；B：黃芪異黃烷苷與JUN蛋白結(jié)合；C：白樺脂酸與VEGFA蛋白結(jié)合；D：葉酸與JUN蛋白結(jié)合圖9 黃芪核心成分靶點(diǎn)結(jié)合卡通模式圖

3 討論

DPVD歸屬中醫(yī)“血痹”“脫疽”范疇，屬消渴并發(fā)癥類，病機(jī)屬氣陰兩虛，可兼夾濕痰等，中醫(yī)藥治療DPVD具有較好的療效[11]?！盃I氣虛則不仁”(麻木不仁、不會(huì)感知)，“衛(wèi)氣虛則不用”(不能視聽言動(dòng))。黃芪為補(bǔ)氣之要藥，尤擅長補(bǔ)營衛(wèi)之氣，能夠補(bǔ)充DPVD患者中氣虛之象，氣旺則血行，氣血充盈，周身濡養(yǎng)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺發(fā)現(xiàn)黃芪有87種成分，運(yùn)用DL值和OB值篩選出20種有效成分，對應(yīng)成分靶點(diǎn)104個(gè)，通過繪制交集韋恩圖，篩選出主要成分16種，核心靶點(diǎn)98個(gè)，占黃芪成分靶點(diǎn)的94%，富集主要GO和KEGG通路20條，提示黃芪能夠調(diào)控動(dòng)脈硬化和血管壓力、糖尿病并發(fā)癥糖基化代謝、TNF、IL-17炎癥調(diào)節(jié)、EGFR血管內(nèi)皮生長因子通路調(diào)控等通路，介導(dǎo)核受體活性、G蛋白耦聯(lián)受體、膽固醇激素等受體活性，在治療DPVD中能夠發(fā)揮多靶點(diǎn)調(diào)控效應(yīng)。黃芪治療DVPD與IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、VEGFA、EGF、IL-1B等基因調(diào)控密切相關(guān)，下游蛋白存在較強(qiáng)的相互作用，而這些蛋白多與DPVD中炎癥因子、血管再生、信號凋亡通路等密切相關(guān)。研究表明，異鼠李素(MOL000354)能夠改善 α-葡萄糖苷酶活性調(diào)節(jié)血糖[12]；刺芒柄花素(MOL000392)通過調(diào)節(jié)大鼠子宮、胸主動(dòng)脈和乳腺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中IGF-1R和ICAM-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[13]；毛蕊異黃酮(MOL000417)能夠促進(jìn)血管新生、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮[14]。槲皮素(MOL000098)能夠調(diào)控PI3K/Akt促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮修復(fù)[15]。黃芪主要成分中黃芪異黃烷苷、葉酸、白樺脂酸與DPVD平均結(jié)合能均較高，能夠與轉(zhuǎn)錄因子AP-1和血管內(nèi)皮生長因子靶點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生較穩(wěn)定結(jié)合，提示這3種成分可能在黃芪治療DPVD中發(fā)揮重要作用。林輝等[16]通過采用不同劑量葉酸(MOL000433)干預(yù)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者，臨床研究發(fā)現(xiàn)，葉酸具有改善血管內(nèi)皮功能。白樺脂酸(MOL000211)具有穩(wěn)定的抗炎作用，可以影響多重炎癥信號通路[17]。而目前黃芪異黃烷苷的研究較少，但通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測其可能為黃芪治療DPVD的核心成分之一，在今后研究中可以進(jìn)一步對其進(jìn)行挖掘研究。

本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)，探討了黃芪治療DPVD中可能存在的內(nèi)在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)黃芪主要成分可能對DPVD發(fā)揮多靶點(diǎn)調(diào)控作用，并通過分子對接發(fā)現(xiàn)黃芪主要成分均能與DPVD核心靶點(diǎn)有較好的穩(wěn)定結(jié)合，提示黃芪可能在治療DPVD中發(fā)揮重要作用，為臨床診療及DPVD分子機(jī)制研究提供一定的參考。