全無瑕，繆延棟

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy，ICM)是由冠狀動(dòng)脈狹窄、阻塞等引起心肌壞死、重構(gòu)，導(dǎo)致左室舒縮功能障礙的一類疾病，是心力衰竭最常見和最致命的原因[1]。中醫(yī)藥作為我國最受歡迎的補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)模式之一，因其療效明顯、資源豐富、毒性低而逐漸被外國人所接受，并在西方國家得到越來越多的應(yīng)用[2-3]。在ICM的臨床治療中，有許多中成藥、中藥湯劑和中藥注射劑單獨(dú)或作為常規(guī)治療的輔助藥物[4-6]。

參附湯和苓桂術(shù)甘湯都是常用的中藥方劑。參附湯由人參和附子兩味中藥組成，廣泛應(yīng)用于慢性心力衰竭治療[7]。苓桂術(shù)甘湯由茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草四味中藥組成，不僅可用于治療ICM，而且在二級預(yù)防方面發(fā)揮不可替代的作用[5]。黃芪是豆科黃芪屬植物，廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，其中包括ICM[8-9]。在臨床上，對部分心腎陽虛證的病人，推薦采用參附湯合苓桂術(shù)甘湯加減治療，其組方主要為人參(紅參)、炮附子、黃芪、茯苓、桂枝、白術(shù)、澤瀉、車前子等[10-11]。然而，該中藥湯劑治療心臟病，特別是ICM的藥理過程和分子機(jī)制尚未明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以參附湯合苓桂術(shù)甘湯加減治療ICM作為研究對象，對藥物治療靶點(diǎn)進(jìn)行發(fā)掘，通過構(gòu)建一個(gè)特定的“中藥活性成分-靶點(diǎn)-藥理”的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，評價(jià)中藥的合理性和相容性。探究參附湯合苓桂術(shù)甘湯加減治療ICM的活性成分和潛在的靶基因以及基因相關(guān)的功能和介導(dǎo)的通路，從而進(jìn)一步闡明其藥理作用及分子機(jī)制，為現(xiàn)代中藥的研究和開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 差異基因表達(dá)分析 從GEO數(shù)據(jù)庫基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GSE5406)中提取108例ICM病人與16名正常人心肌的基因表達(dá)量并進(jìn)行差異分析。采用Wilcox檢驗(yàn)和Limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)注釋，log∣FC∣>0.5，P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用R軟件包“pheatmap”進(jìn)行雙向?qū)哟尉垲惙治霾⒗L制熱圖。所有數(shù)據(jù)分析采用R軟件(版本3.6.2)和草莓版Perl(5.30.1.1)軟件。

1.2 篩選參附苓桂術(shù)甘湯加減方中藥物的活性成分與靶點(diǎn) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)以參附苓桂術(shù)甘湯加減方中8味中藥(紅參、炮附子、黃芪、茯苓、桂枝、白術(shù)、澤瀉、車前子)為關(guān)鍵詞檢索其化學(xué)成分?？诜锢枚?oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug- likeness，DL)≥0.18為指標(biāo)篩選各藥中活性成分[12]，同時(shí)下載有效成分的人源靶點(diǎn)信息。

1.3 構(gòu)建中藥化合物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作(protein-protein interactive，PPI)網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape軟件(3.7.2版)構(gòu)建中藥活性成分和靶點(diǎn)基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過Bisogenet 插件(3.0.0版)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。然后使用CytoNCA 插件(2.1.6版)對這些節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湓u分進(jìn)行綜合計(jì)算、評估和可視化分析，度值(degree centrality，DC)和中心度值(betweenness centrality，BC)，“Without weight”為篩選參數(shù)。DC的最小篩選值為61，BC為600。

1.4 靶點(diǎn)基因功能注釋與通路分析 為了探究靶點(diǎn)基因的功能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，采用R軟件進(jìn)行靶基因的功能注釋和通路分析。功能富集主要通過基因本體(gene ontology，GO)富集分析，分為生物過程(biological processes，BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)或分子功能(molecular functions，MF)3類。京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)揭示已鑒定基因的生物信息及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。基因數(shù)≥2和偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為測定富集項(xiàng)的顯著性閾值。此外，利用Perl腳本和Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 ICM中差異基因的表達(dá) 從GSE5406數(shù)據(jù)集中共篩選出211個(gè)與ICM有關(guān)的差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因88個(gè)，下調(diào)基因123個(gè)，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前20個(gè)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因以熱圖展示(見圖1)，所有的差異基因以火山圖展示(見圖2)。

圖1 ICM病人心肌細(xì)胞基因表達(dá)熱圖 [紅色小正方形代表上調(diào)基因(logFC>0.5，P<0.05)；綠色小正方形代表下調(diào)基因(-logFC>0.5，P<0.05)]

圖2 ICM中差異基因的表達(dá)量火山圖[紅色小圓點(diǎn)代表上調(diào)基因(logFC>0.5，P<0.05)；綠色小圓點(diǎn)代表下調(diào)基因(-logFC>0.5，P<0.05)]

2.2 參附苓桂術(shù)甘湯加減方中生物活性成分的篩選 通過TCMSP共檢索到8味中藥的化合物，共有636種成分，在這些成分中，324個(gè)(50.9%)成分的OB≥30%，其中，93個(gè)(28.7%)成分OB≥30%并且DL≥0.18。所有成分詳見表1。

表1 參附苓桂術(shù)甘湯加減方中8味中藥OB≥30%、DL≥0.18的成分?jǐn)?shù)目 單位：種(%)

2.3 中藥活性成分和藥物靶點(diǎn)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 探索中醫(yī)藥的分子機(jī)制是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化的關(guān)鍵，明確中醫(yī)藥治療疾病的靶點(diǎn)基因是重中之重。在本研究中，構(gòu)建了參附苓桂術(shù)甘湯治療ICM的活性成分-靶基因之間的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，該網(wǎng)絡(luò)由31個(gè)節(jié)點(diǎn)組成(外周20個(gè)節(jié)點(diǎn)是中藥生物活性成分，中間11個(gè)節(jié)點(diǎn)是潛在靶點(diǎn)基因)。這些靶點(diǎn)基因包括HSP90AA1、CDKN1A、POR、MYC、GJA1、SERPINE1、CCL2、COL1A1、COL3A1、PCOLCE、ADH1B，他們與20種生物活性成分密切相關(guān)。除了MOL000358、MOL000296和MOL000098分別來源于兩種中藥外，其余17種生物活性成分均來自單一中藥，詳見表2。紅參、附子、茯苓、桂枝、黃芪、車前子6味中藥在參附苓桂術(shù)甘湯加減方治療ICM的治療過程中發(fā)揮著重要作用。尤其是黃芪，是該組方中的最關(guān)鍵藥物，20個(gè)生物活性成分中11個(gè)來源于黃芪。

圖3 中藥復(fù)方靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖[橢圓形表示從草藥中提取的活性化合物，黃芪(黃色)、車前子(淡綠色)、桂枝(紫色)、附子(黃褐色)和多種中藥(紅色)；藍(lán)色三角形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)基因。連線表示活性成分和靶點(diǎn)基因之間的相互作用]

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) 通過Bisogenet插件構(gòu)建了11個(gè)靶點(diǎn)基因與其相關(guān)聯(lián)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)圖中共包括1 648個(gè)基因。由CytoNCA插件篩選出核心基因，DC最小值為61，共篩選出有269個(gè)基因(見圖4A)。在此基礎(chǔ)上，通過BC最小值600共篩選出19個(gè)核心基因(見圖4B)。其中包括HSP90AA1和MYC兩個(gè)靶點(diǎn)基因，核心網(wǎng)絡(luò)中的這些基因可能是ICM發(fā)病的關(guān)鍵基因，特別是高度值基因，如HSP90AA1(degree=811)、MYC(degree=595)、HSP90AB1(degree=573)和NTRK1(degree=519)。

活性成分編碼 分子名稱OB(%)DL所屬中藥MOL001735dinatin(洋毛地黃次黃酮)30.970.27車前子MOL007819hypolaetin33.240.28車前子MOL007813dihydrotricetin58.120.28車前子MOL002388delphin_qt(飛燕草甙)57.760.28附子MOL000073ent-epicatechin(表兒茶素)48.960.24桂枝 MOL000492(+)-catechin(兒茶素)54.830.24桂枝MOL004576taxifolin(花旗松素,紫杉葉素)57.840.27桂枝MOL001736(-)-taxifolin(花旗松素,紫杉葉素)60.510.27桂枝MOL000380(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol64.260.42黃芪MOL000417calycosin(毛蕊異黃酮)44.750.24黃芪MOL000239jaranol50.830.29黃芪MOL000392formononetin(芒柄花黃素)69.670.21黃芪MOL0004421,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene39.050.48黃芪MOL000354isorhamnetin(異鼠李素)49.600.31黃芪MOL000387bifendate(聯(lián)苯雙酯)31.100.67黃芪MOL0003787-O-methylisomucronulatol74.690.30黃芪MOL000422kaempferol(山奈酚,莰非醇)41.880.24黃芪MOL000358beta-sitosterol(β-谷甾醇)36.910.75紅參,桂枝MOL000296hederagenin(常春藤皂甙元)36.910.75黃芪,茯苓M(jìn)OL000098quercetin(槲皮素,五羥黃酮)46.430.28黃芪,車前子

圖4 Bisogenet 和CytoNCA插件篩選核心基因的過程[A為從1 648個(gè)基因中篩選出269個(gè)基因(DCmin值=61)的過程；B為從269個(gè)基因中篩選出19個(gè)基因(BCmin值=600)的過程。黃色節(jié)點(diǎn)代表選定的基因；粉色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)基因；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表鄰居基因]

2.5 GO功能注釋和KEGG通路分析 為了詳細(xì)了解上述靶點(diǎn)基因的生物學(xué)特性，利用R軟件對11個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行了GO功能注釋和KEGG富集分析。GO功能注釋結(jié)果顯示，包含176個(gè)BP條目、7個(gè)條目涉及CC和8個(gè)MF條目，基因數(shù)目≥2和FDR<0.05作為篩選值。主要涉及DNA合成過程的調(diào)控、DNA生物合成的過程、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶結(jié)合等與心肌纖維化相關(guān)的生物作用。主要富集的基因包括HSP90AA1、CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1。GO功能注釋詳見圖5～圖7。

圖5 參附苓桂術(shù)甘湯作用靶點(diǎn)的GO富集分析BP圖

圖6 參附苓桂術(shù)甘湯作用靶點(diǎn)的GO富集分析CC圖

圖7 參附苓桂術(shù)甘湯作用靶點(diǎn)的GO富集分析MF圖

KEGG富集分析結(jié)果顯示，上述靶點(diǎn)基因主要參與5條通路的調(diào)控過程。在這些信號通路中，PI3K-Akt信號通路(hsa04151)是最重要的通路，其基因豐度最高，共有4個(gè)基因參與該通路調(diào)控過程(HSP90AA1、CDKN1A、MYC和COL1A1，見圖8)。同時(shí)，參與這些通路調(diào)控的關(guān)鍵基因(CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1、和HSP90AA1)中CDKN1A基因(參與了全部5條通路的調(diào)控)和MYC基因(參與3條信號通路的調(diào)控)尤為重要。因此，可以推測他們在ICM的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是參附苓桂術(shù)甘湯加減方治療ICM過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因(見圖9)。通過藥物靶點(diǎn)預(yù)測、GO注釋和KEGG通路富集分析，推測參附苓桂術(shù)甘湯加減方對ICM的作用可能與其關(guān)鍵靶點(diǎn)CDKN1A、MYC、SERPINE1、COL1A1和HSP90AA1在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能中的作用有關(guān)。

圖8 KEGG通路富集分析圖

圖9 靶基因和通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(紅色倒三角形節(jié)點(diǎn)表示信號通路，棕黃色節(jié)點(diǎn)表示靶基因。連線代表了他們之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的大小與他們參與調(diào)控信號通路的基因數(shù)目或基因參與調(diào)控的信號通路數(shù)成正比)

3 討 論

ICM以慢性心力衰竭為主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)證候特征為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜[13]。中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸于“喘證”“心悸”“水腫”等范疇，其發(fā)病機(jī)制為心氣不足、心腎陽虛引起痰瘀水泛，在中醫(yī)臨床治療上應(yīng)著重關(guān)注益氣溫陽、活血利水[14]。參附湯和苓桂術(shù)甘湯均為中醫(yī)益氣溫陽的經(jīng)典方，組方中紅參補(bǔ)元?dú)?，制附子溫陽，兩者合用發(fā)揮益心氣、溫心陽的功效；黃芪補(bǔ)氣升陽、利水消腫，茯苓、白術(shù)健脾益氣利水；桂枝溫陽化軟，白術(shù)祛濕并健脾益氣；澤瀉、車前子等有利水消腫之效。諸藥合用共奏益氣溫陽、活血利水的功效[10-11]。

本研究通過構(gòu)建中藥活性成分和靶點(diǎn)之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從分子層面闡明參附湯和苓桂術(shù)甘湯治療ICM的作用機(jī)制。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，可以持續(xù)降低心肌梗死病人血清膽固醇和β-脂蛋白脂質(zhì)水平[15]。劉佳慰等[16]發(fā)現(xiàn)常春藤皂甙元具有一定的降脂效果。槲皮素可以有效緩解自身免疫性心肌炎[17-18]。毛蕊異黃酮、芒柄花黃素等黃芪生物活性成分可以提高缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞存活率、三磷酸腺苷(ATP)含量，同時(shí)影響過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)[19-20]；芒柄花黃素可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化性單核細(xì)胞黏附和炎癥反應(yīng)[21]。異鼠李素通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶-1(HO-1)介導(dǎo)的抗氧化信號通路，對心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[22]。此外，山奈酚可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激減輕心臟損傷[23]。兒茶素可以治療限制性心肌病[24]，同時(shí)兒茶素沒食子酸酯對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[25]。紅豆杉中分離的植物黃酮紫杉葉素可以減輕心肌肥厚，改善心功能，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和減弱凋亡途徑[26]。Dihydrotricetin的心臟保護(hù)作用可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)信號通路防止體內(nèi)和體外缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27]。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在中醫(yī)藥作用機(jī)制分析中具有重要作用。同時(shí)，本研究中還有一些活性成分的心肌細(xì)胞保護(hù)作用尚未見報(bào)道，值得進(jìn)一步探究。其次，通過分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的11個(gè)靶點(diǎn)基因，最終發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)基因HSP90AA1、MYC與高度值基因HSP90AB1、NTRK1最為關(guān)鍵。HSP90AA1已被證實(shí)與冠心病相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路相關(guān)[28-29]。Birket等[30]發(fā)現(xiàn)MYC參與類胰島素樣生長因子-1對心血管祖細(xì)胞的調(diào)控過程，而且MYC與調(diào)節(jié)維持收縮力心臟傳導(dǎo)基因的表達(dá)具有拮抗關(guān)系[31]。HSP90AB1已被證實(shí)可以防止心肌缺血再灌注損傷和細(xì)胞凋亡[32]。另外，HSP90AA1和HSP90AB1參與病理性心臟重塑小鼠主動(dòng)脈束帶模型中的心臟重塑過程[33]。Preston等[34]發(fā)現(xiàn)NTRK1與某些心房顫動(dòng)的潛在性驅(qū)動(dòng)因素相關(guān)。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重建廣泛應(yīng)用于多種心臟病，能阻礙心臟充盈，常導(dǎo)致心力衰竭[35-36]。PI3K/Akt在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的生理性心肌肥大和心臟保護(hù)的過程中起重要作用[37]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑可減少心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管再生并減輕心室重構(gòu)[38]。有研究表明，高血糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡通過體內(nèi)Nkx2.5-Calr-p53途徑的激活介導(dǎo)，從而導(dǎo)致心臟功能障礙和高血糖癥引起的心肌病[39]。內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)與心肌細(xì)胞酪氨酸激酶受體2(ErbB)信號通路之間的關(guān)系可導(dǎo)致心肌肥大與血管生成，有助于生理性心臟生長[40-41]。研究表明，在成年心臟中，低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)可以防止心肌缺氧[42]。先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Serpine1可控制心內(nèi)膜的成熟和增殖以及心肌細(xì)胞的增殖[43]。此外，有研究表明，CDKN1A可以在心臟發(fā)育過程中調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖[44]。由此可見，參附苓桂術(shù)甘湯加減方在治療ICM中的心肌保護(hù)作用主要通過活性成分作用于上述基因，參與調(diào)控相關(guān)信號通路，尤其是PI3K/Akt-p53凋亡途徑發(fā)揮著重要的作用，進(jìn)一步研究其藥理機(jī)制將是今后的研究方向。

綜上所述，基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的“中藥活性成分-靶點(diǎn)基因-藥理”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確了參附苓桂術(shù)甘湯加減治療ICM的藥理作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)一些靶點(diǎn)基因HSP90AA1、MYC、CDKN1A、SERPINE1和COL1A1在此過程中發(fā)揮著重要作用，這些基因可能具有診斷和治療價(jià)值。有研究表明，參附苓桂術(shù)甘湯加減治療ICM，主要通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt、p53、ErbB等信號通路來實(shí)現(xiàn)。由此可見，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以作為一種非常有用的工具預(yù)測靶點(diǎn)基因，從而深入研究中藥治療疾病的作用機(jī)制，為現(xiàn)代中藥的研究和開發(fā)提供新思路。