趙 婷，袁 萌，晉湘宜，李 良，李俊微，方尚玲

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050)

酚酸脫羧酶(phenolic acid decarboxylase，PAD)是一種能夠催化酚酸類物質(zhì)發(fā)生非氧化脫羧反應(yīng)(nonoxidative decarboxylation)的蛋白酶，可以催化分解酚酸類物質(zhì)產(chǎn)生4-乙烯基衍生物[1]。酚酸類物質(zhì)的4-乙烯基衍生物中的4-乙烯基苯酚有藥物和辛香風(fēng)味，可用于食品添加劑及香精香料行業(yè)[2-4]，對葡萄酒和其他發(fā)酵食品和飲料的香氣形成具有重大貢獻(xiàn)[5]。

酶在溫和的反應(yīng)條件下（低溫和低壓下，pH值介于5～8之間）具有較高活性，還能減少副反應(yīng)的發(fā)生[6]。但由于受到溫度、pH值、酶液濃度、溶劑等因素的影響，游離酶的催化活性很低甚至容易失活。酶的固定技術(shù)可以克服這些問題，與游離酶相比，固定化有助于增強(qiáng)酶在苛刻環(huán)境中的穩(wěn)定性，提高酶的催化活性和儲存穩(wěn)定性；另外，固定化酶可以更快速地從反應(yīng)體系中分離出來，從而最大限度地減少或消除產(chǎn)物對酶的污染，促進(jìn)了酶的有效回收和循環(huán)利用[7-9]。

本試驗(yàn)從解淀粉芽胞桿菌中克隆表達(dá)得到了酚酸脫羧酶的重組菌株，分別選用殼聚糖、海藻酸鈉、大孔樹脂，不同的交聯(lián)劑進(jìn)行酶的固定化，并對殼聚糖固定酚酸脫羧酶進(jìn)行優(yōu)化，從而確定酚酸脫羧酶的最佳固定方案，使其能夠更好的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株細(xì)胞：解淀粉芽胞桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)，天根生化科技(北京)有限公司。

試劑及耗材：殼聚糖，海藻酸鈉，大孔樹脂（HPD700，X-5），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和無水碳酸鈉，F(xiàn)e3O4，三聚磷酸鈉，戊二醛，新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑，冰乙酸，均為分析純試劑；甲醇，色譜純試劑。質(zhì)粒pMD18-T和Taq聚合酶，TaKa-Ra公司；質(zhì)粒 pET-28a(+)，Novagen公司。細(xì)菌DNA試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，Biomiga公司；限制性內(nèi)切酶 NcoI、XhoI和T4 DNA連接酶，New England Biolabs公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；對香豆酸、4-乙烯基衍生物，上海源葉生物技術(shù)有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。

儀器設(shè)備：S1000梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司；MiniProGel蛋白制膠與電泳系統(tǒng)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MultifugeX1R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（上海）有限公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江金壇市富華儀器有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 克隆與表達(dá)

根據(jù)細(xì)菌DNA試劑盒說明書從解淀粉芽胞桿菌中提取總DNA，根據(jù)NCBI上（登錄號：NC_000964.3）酚酸脫羧酶的基因序列設(shè)計(jì)該基因的特異性引物，正向引物：5′-CATGCCATGGCCATGGAAAACTTTATCGGAAGCCATA-3′，反向引物序列 ：5′-CCGCTCGAGTTTTAATTTTCCCGCGCGAATA-3′。PCR反應(yīng)體系如表1所示，PCR反應(yīng)條件如表2所示。

表1 PCR的反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)條件

通過PCR擴(kuò)增得到的酚酸脫羧酶基因與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測序驗(yàn)證并保存?；谳d體上攜帶的抗性基因，每100 mL培養(yǎng)基中添加100 μL的100 mg/mL氨芐抗生素。提取重組質(zhì)粒擴(kuò)增目的基因進(jìn)行雙酶切(NcoI和XhoI)，與pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測序驗(yàn)證。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒在250 mL錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，以37℃、180 r/min培養(yǎng)3.5 h，添加200μL的500 mmol/L IPTG以21℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)18 h，每100 mL培養(yǎng)基中添加100 μL的100 mg/mL卡那抗生素。

1.2.2 酶的純化和表達(dá)量測定

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的菌液以8000 r/min離心5 min取下層沉淀，加入10 mL濃度為50 mol/L的Tris-HCl(pH 7.0)重懸。超聲波處理酶液的參考系數(shù)為：每次處理的菌懸液為10 mL，輸出功率300 W，間歇時(shí)間5 s，工作時(shí)間5 s，全部時(shí)間15 min。8000 r/min離心5 min取上清液得到粗酶液。在?KTA FPLC純化系統(tǒng)上使用鎳瓊脂糖凝膠柱(1×10 cm)和50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)純化粗酶液，該緩沖液分別由300 mmol/L的NaCl和不同濃度(40 mmol/L、45 mmol/L、250 mmol/L)的咪唑組成。在SDS-PAGE上電泳分析空載的大腸桿菌BL21(DE3)蛋白質(zhì)樣品、粗酶液蛋白質(zhì)樣品和純化的酶液蛋白質(zhì)樣品，并通過考馬斯亮藍(lán)染色將凝膠中的蛋白質(zhì)可視化，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3 酶活力的測定

將底物對香豆酸配制成50 mmol/L的溶液，反應(yīng)體系為1 mL，含有0.8 mL Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH6.0)、0.1 mL的50 mmol/L底物、0.1 mL酚酸脫羧酶液，37℃水浴反應(yīng)5 min后加入2 mL甲醇終止反應(yīng)。0.22μm濾膜過濾后用HPLC（高效液相色譜儀）測定生成的4-乙烯基衍生物含量。將0.1 mL酶液替換成0.1 mL緩沖液，并在相同條件下反應(yīng)的樣品為對照。定義每分鐘產(chǎn)生1 μmol 4-乙烯基衍生物的酶量為1 IU，酚酸脫羧酶酶活力單位為IU/mL。

酚酸脫羧酶活力(IU/mL)＝cx/VT

其中：c——所加酶液的量，mL；

x——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的4-乙烯基衍生物含量，mmol/L；

V——酶促反應(yīng)體系的最終體積，mL；

T——酶促反應(yīng)時(shí)間，min。

用UltiMate 3000高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定。Hypersil GOLDC18色譜柱(3 μm，4.6×250 mm)。流動相甲醇∶0.1%乙酸=40∶60(v/v)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，檢測波長280 nm。

1.2.4 不同材料固定酚酸脫羧酶

1.2.4.1 殼聚糖的固定化

將2 g殼聚糖溶解于100 mL的2%醋酸溶液中，攪拌使其形成透明均一的膠體，然后用1 mL注射器將其滴到4 mol/L的NaOH溶液中（保持針頭和液面垂直），形成微球，然后一直用蒸餾水洗，直至中性。將制好的殼聚糖微球加入到一定的1.5%戊二醛中，30℃下恒溫水浴搖床搖動3 h，再用蒸餾水反復(fù)洗去戊二醛，將殼聚糖小球保存于4℃下備用。稱取0.5 g的殼聚糖微球，加入10 mL的酚酸脫羧酶液，4℃振蕩交聯(lián)16 h后，用蒸餾水洗去多余酶液即得固定化酶。

1.2.4.2 磁性殼聚糖微球的固定化

取0.2 g的Fe3O4溶于50 mL的三聚磷酸鈉（TPP）溶液中，進(jìn)行超聲溶解，然后用1 mL注射器將其逐滴加入2%的殼聚糖溶液中。隨著殼聚糖與三聚磷酸鈉形成凝膠微球，納米Fe3O4被殼聚糖包裹其中，從而形成殼聚糖包裹的磁性微球。用強(qiáng)磁鐵塊進(jìn)行收集、洗滌3次，并冷凍干燥。用去離子水重復(fù)收集、洗滌、收集3次，去除多余三聚磷酸鈉溶液。取一定量的磁性殼聚糖微球水重懸液作為固定化酶的載體。加入一定體積的1.5%戊二醛，避光置于25℃，120 r/min條件下進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)結(jié)束后，用去離子水洗滌3次，去除多余戊二醛。之后，加入5 mL pH6.0的0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液重懸載體，并加入一定量的酚酸脫羧酶，25℃、120 r/min條件下進(jìn)行酶的固定化[10]。

1.2.4.3 海藻酸鈉的固定化

將4 g/L海藻酸鈉緩慢加入溫水中并迅速攪拌，等其溶化均勻后按體積比1∶1與粗酶液混合后靜置片刻。取2.5 mL注射器吸取混合液，緩慢滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，固定42 min后，緩慢攪拌，并過濾。得到的球狀固定化酶用去離子水洗滌，加入戊二醛溶液在26℃下進(jìn)行交聯(lián)。完成交聯(lián)后用去離子水洗滌，即得到酚酸脫羧酶固定酶[11]。

1.2.4.4 大孔樹脂的固定化

將兩種大孔樹脂AB-8、X-5分別用無水乙醇浸12 h，然后用蒸餾水沖洗至無醇，保存于4℃冰箱備用。取適量處理好的AB-8、X-5大孔樹脂，用濾紙擦干表面水分，分別稱取1.0 g放入PE管中，加入10 mL酶液，200 r/min振蕩吸附4 h，過濾即得固定化酶，晾干12 h，40℃烘干4 h。向吸附完成的體系中加入一定體積的1.5%戊二醛，40℃、120 r/min下振蕩4 h，交聯(lián)完成。

1.2.5 殼聚糖固定酚酸脫羧酶的優(yōu)化

1.2.5.1 交聯(lián)劑對固定化酶效率的影響

按照2%殼聚糖濃度，30℃下恒溫水浴搖床搖動交聯(lián)3 h，分別選用1.5%戊二醛和1.5%新戊二醇二縮水甘油醚作為交聯(lián)劑，4℃振蕩交聯(lián)16 h，考察不同交聯(lián)劑對固定化酚酸脫羧酶的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.2 交聯(lián)劑濃度對固定化酶效率的影響

按照2%殼聚糖濃度，30℃下恒溫水浴搖床搖動交聯(lián)3 h，4℃振蕩交聯(lián)16 h，考察新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%對固定化酚酸脫羧酶的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.3 固定化時(shí)間對固定化酶效率的影響

按照2%殼聚糖濃度，1.5%新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑，在30℃下恒溫水浴搖床搖動交聯(lián)，考察固定化時(shí)間分別為10 h、12 h、14 h、16 h、18 h對固定化酚酸脫羧酶的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.4 殼聚糖濃度對固定化酶效率的影響

按照1.5%新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑，在30℃下恒溫水浴搖床搖動交聯(lián)3 h，考察殼聚糖濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%對固定化酚酸脫羧酶的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸脫羧酶基因的克隆及表達(dá)

以解淀粉芽胞桿菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，該片段全長為489 bp，編碼162個(gè)氨基酸。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析的結(jié)果如圖2所示。

圖1 酚酸脫羧酶瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 酚酸脫羧酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.2 不同材料固定化酚酸脫羧酶

為了找到最經(jīng)濟(jì)合適的固定化材料，分別選取了殼聚糖、海藻酸鈉、磁性殼聚糖、兩種大孔樹脂作為固定化材料，其結(jié)果如表3所示。不同材料的固定化效果不同，其中大孔樹脂的固定化效果最差，殼聚糖的固定化效果最好，達(dá)到了75%。

表3 不同材料的固定化率

2.3 殼聚糖固定酚酸脫羧酶的優(yōu)化

為了進(jìn)一步增加固定化的效果，對殼聚糖固定酚酸脫羧酶的方法進(jìn)行優(yōu)化，包括交聯(lián)劑類型（戊二醛，新戊二醇二縮水甘油醚交聯(lián)劑），殼聚糖濃度，交聯(lián)時(shí)間，交聯(lián)劑含量。

結(jié)果如圖3所示，選擇殼聚糖的濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，當(dāng)濃度過低時(shí)固定化效果僅為60%，此時(shí)觀察到殼聚糖微球比較小，不容易成球，容易分散，導(dǎo)致其固定化效果差。當(dāng)濃度過高時(shí)，此時(shí)殼聚糖形成的球很厚很結(jié)實(shí)，可能導(dǎo)致孔隙過于緊密，固定化效果也不理想。因此，當(dāng)殼聚糖濃度為2%時(shí)，此時(shí)的固定化效果最佳。

圖3 殼聚糖濃度對酶固定化的影響

如圖4所示，當(dāng)分別選擇戊二醛和新戊二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑時(shí)，不管是低濃度還是高濃度下，新戊二醇二縮水甘油醚的固定化效果都強(qiáng)于戊二醛。并且，由于戊二醛呈帶有刺激性氣味，可引起局部皮膚黏膜刺激，對人體的毒性遠(yuǎn)大于新戊二醇二縮水甘油醚，所以選用新戊二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑。

圖4 兩種交聯(lián)劑對酶固定化的影響

如圖5所示，當(dāng)固定化時(shí)間小于12 h時(shí)，酚酸脫羧酶的固定化效果隨著固定化時(shí)間的延長而增加，可能是因?yàn)楣潭ɑ瘯r(shí)間過短導(dǎo)致酶還沒有固定好，當(dāng)固定12 h時(shí)，固定效果達(dá)到最佳。而隨著固定化時(shí)間的逐漸延長，酶逐漸失活，固定效率反而降低。因此，固定化的最佳時(shí)間為12 h。

圖5 時(shí)間對酶固定化的影響

如圖6所示，當(dāng)新戊二醇二縮水甘油醚的濃度低于1.5%時(shí)，酚酸脫羧酶的固定化效果隨著交聯(lián)劑濃度的增加而增加，當(dāng)交聯(lián)劑濃度為1.5%時(shí)，固定化效果達(dá)到最佳。而隨著交聯(lián)劑濃度的升高，酚酸脫羧酶的固定化效果逐漸降低，可能是因?yàn)榻宦?lián)劑濃度過高導(dǎo)致酶失活。因此，新戊二醇二縮水甘油醚濃度為1.5%最佳。

圖6 DCNG濃度對酶固定化的影響

3 結(jié)論

分別選擇不同的方法和材料對酚酸脫羧酶進(jìn)行固定，結(jié)果表明，殼聚糖的固定方法最佳，并且殼聚糖材料經(jīng)濟(jì)易得。進(jìn)一步對殼聚糖固定酚酸脫羧酶的方案進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖濃度2%，固定化時(shí)間12 h，交聯(lián)劑為1.5%新戊二醇二縮水甘油醚，此時(shí)的固定化效果最佳，達(dá)到93%。

由于在天然狀態(tài)下，酶的穩(wěn)定性較差，且基本都是一次性使用，很難進(jìn)行重復(fù)利用，而酶經(jīng)過適宜條件的固定化后，各項(xiàng)穩(wěn)定性及耐受性質(zhì)將會得到一定的提升，并能很好的進(jìn)行回收再利用，所以我們對重組的酚酸脫羧酶進(jìn)行了固定化研究。本研究是源自解淀粉芽胞桿菌的酚酸脫羧酶的第一次固定化，經(jīng)過優(yōu)化的酚酸脫羧酶固定化效果很好，能夠利用此類方法進(jìn)行固定化并使用，降低酶的生產(chǎn)及使用成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條可能的道路。