馬小晴，郎豐龍，趙 爽，張 強(qiáng)

（撫順市中心醫(yī)院，遼寧 撫順 113006）

缺血性腦血管病多發(fā)于中老年人，發(fā)病率、致殘率和病死率均較高，如未及時治療，可導(dǎo)致腦組織不可逆損傷，及時治療后患者仍有復(fù)發(fā)可能，且多數(shù)患者留有偏癱、失語等后遺癥，給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。臨床上治療缺血性腦血管病主要通過重建血流，恢復(fù)缺血區(qū)血液供應(yīng)以減少腦損傷。近年臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦組織血管自然再通或經(jīng)溶栓治療恢復(fù)血流后，再灌注的血流可引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，從而加重腦組織損傷，導(dǎo)致腦組織缺血再灌注損傷[3]。補(bǔ)陽還五湯是臨床治療缺血性腦血管病常用方劑之一，有益氣活血之功效，血塞通主要成分為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等作用[4-5]。補(bǔ)陽還五湯和血塞通用于治療缺血性腦血管病已有文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，但兩者合用對于缺血再灌注損傷的報(bào)道較少。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，模擬缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦梗死過程，觀察補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合血塞通的益氣活血法對局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療缺血性腦血管病提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 7周齡SPF級健康雄性SD大鼠114只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠購入后于通風(fēng)環(huán)境，溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)撫順市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會審批通過。

1.2 藥物與試劑 注射用血塞通凍干粉（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20026437，規(guī)格：400 mg，批號：20170603）；補(bǔ)陽還五湯煎液（本院自制）；TTC染色液（2%）（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G3005）；兔抗大鼠無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員3a（wingless-type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a）單抗（貨號：ab219412）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）單抗（貨號：ab93926）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）單抗（貨號：ab184919）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）單抗（貨號：ab134175）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）多抗（貨號：ab196495）、Bax單抗（貨號：ab182733）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（貨號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 101-1A烘箱（上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；SLAN-96P/SLAN-96S/48P實(shí)時熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；DYCZ-20H型高通量垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 造模與分組 取80只大鼠，禁食不禁水12 h，采用大腦中動脈栓塞法[8]建立局灶性腦缺血再灌注模型。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定，縱切左側(cè)頸部正中部位皮膚暴露頸總動脈，分離頸外和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，夾閉頸內(nèi)動脈、頸總動脈，將線栓自頸總動脈向顱內(nèi)方向插入，插入深度18～20 mm至出現(xiàn)阻力，結(jié)扎線栓切口下方，松開動脈夾。術(shù)后大鼠加電熱毯保暖，記錄缺血開始時間，2 h后緩慢拔出線栓，縫合傷口，使用適量抗生素以防感染。另取17只大鼠為假手術(shù)組，手術(shù)方法同上，僅暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，然后逐層縫合皮膚。剩余17只大鼠為空白組，不做任何處理。

建模成功標(biāo)準(zhǔn)：待大鼠清醒后，參照Longa等[9]的方法對大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分，剔除手術(shù)過程中死亡大鼠，神經(jīng)功能缺損評分2～3分納入實(shí)驗(yàn)。建模成功大鼠共69只，隨機(jī)分為模型組17只，血塞通組17只，補(bǔ)陽還五湯組17只、聯(lián)合組18只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 神經(jīng)缺損評分完畢后，根據(jù)動物與人體等效劑量換算[10]，進(jìn)行給藥。注射用血塞通凍干粉采用專用溶劑溶解后以5%葡萄糖注射液稀釋至質(zhì)量濃度為10 mg/mL備用；補(bǔ)陽還五湯方藥組成：黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，用雙蒸水浸泡4 h，水煎2次（加水量分別是藥材質(zhì)量混度的10倍、8倍，煎煮時間分別為2、1 h），合并煎液濃縮至生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL，pH值調(diào)至7.0備用。給藥方法：血塞通組大鼠尾靜脈注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃生理鹽水（10 mL/kg）；補(bǔ)陽還五湯組大鼠尾靜脈注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃補(bǔ)陽還五湯煎劑（20 g/kg）；聯(lián)合組大鼠尾靜脈注射血塞通溶液（50 mg/kg）+灌胃補(bǔ)陽還五湯煎劑（20 g/kg）；空白組、假手術(shù)組和模型組大鼠尾靜脈注射5%葡萄糖注射液（5 mL/kg）+灌胃生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 分別于缺血再灌注后1、3、7 d，每次干預(yù)后2 h，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，評分方法同前。

1.6.2 大腦含水量 末次干預(yù)后2 h，每組隨機(jī)選取6只大鼠，脫頸處死，斷頭取腦，用濾紙擦干腦組織表面血跡，進(jìn)行稱重，為腦濕質(zhì)量，之后110 ℃烘箱中烘干再次稱重，為腦干質(zhì)量，腦含水量=（腦濕質(zhì)量-腦干質(zhì)量）/腦濕質(zhì)量×100%。

1.6.3 腦梗死體積 末次干預(yù)后2 h，每組隨機(jī)取6只大鼠，脫頸處死后取腦，去除嗅球和小腦，自額極開始間隔2 mm使用切刀連續(xù)切取5張冠狀腦片-20 ℃保存。放入TTC染色液中，37 ℃避光染色，兩面分別染色10～15 min后，4%多聚甲醛中固定過夜。TTC染色后，梗死大腦區(qū)域因無法著色呈現(xiàn)白色，正常腦組織呈紅色，觀察拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件測量梗死區(qū)域面積，腦梗死體積=腦梗死面積×切片厚度（2 mm），分析腦梗死體積百分比，腦梗死體積百分比=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.6.4 腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對表達(dá)量 末次干預(yù)后2 h，脫頸處死各組剩余大鼠，取腦保存于液氮中。取液氮保存腦組織70 mg，采用Trizol法提取總RNA，檢測樣品RNA濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，按照2-△△CT計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.5 腦組 織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量 取液氮保存腦組織70 mg，冰上裂解，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。100 ℃加熱5 min進(jìn)行蛋白變性，制備蛋白上樣液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜分別與1:1 000稀釋的Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、Axin2、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃封閉過夜，洗膜，加入1:4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，常溫?fù)u床孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，曝光。采用Image J軟件分析圖像，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。重復(fù)計(jì)量資料比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 空白組和假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺損癥狀。不同再灌注時間（1、3、7 d）之間大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在時間效應(yīng)，4組均如此；模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分隨著時間延長而升高（P＜0.05），血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組和聯(lián)合組大鼠神經(jīng)功能缺損評分隨著時間延長而降低（P＜0.05）。4組大鼠神經(jīng)功能缺損評分總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)。與模型組比較，血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組和聯(lián)合組大鼠1、3、7 d神經(jīng)功能缺損評分均降低（P＜0.05）；聯(lián)合組大鼠1、3、7 d神經(jīng)功能缺損評分均低于血塞通組和補(bǔ)陽還五湯組（P＜0.05）。時間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（，分）

注：F時間主效應(yīng)=21.326，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=52.469，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=18.497，P交互效應(yīng)=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與血塞通組比較，bP＜0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較，cP＜0.05；與同組內(nèi)1 d比較，dP＜0.05；與同組內(nèi)3 d比較，eP＜0.05

2.2 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較 假手術(shù)組大鼠大腦含水量與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦含水量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組和聯(lián)合組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比均明顯降低（P＜0.05）；聯(lián)合組大鼠腦梗死體積百分比低于血塞通組和補(bǔ)陽還五湯組（P＜0.05）。（見圖1、表3）

圖1 各組大鼠腦切片TTC 染色

表3 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較（，%）

表3 各組大鼠大腦含水量和腦梗死體積百分比比較（，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較，eP＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比較 假手術(shù)組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量均升高，GSK-3β mRNA相對表達(dá)量及Bcl mRNA-2/Bax mRNA均降低（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組和聯(lián)合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與血塞通組和補(bǔ)陽還五湯組比較，聯(lián)合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均升高，GSK-3β mRNA相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相對表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比較（）

表4 各組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA 相對表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA 比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較，eP＜0.05

2.4 各組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax比較 假手術(shù)組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量和Bcl-2/Bax與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量升高，GSK-3β蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）；與模型組比較，血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組和聯(lián)合組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與血塞通組、補(bǔ)陽還五湯組比較，聯(lián)合組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax均升高，GSK-3β蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。（見表5、圖2）

圖2 各組大鼠腦組織Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 各組大鼠腦組織Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax 比較（）

表5 各組大鼠腦組織Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax 比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與血塞通組比較，dP＜0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較，eP＜0.05

3 討 論

缺血性腦血管病的發(fā)病多與血栓形成有關(guān)，由于流向大腦的血流供應(yīng)不足或中斷，引起腦組織局部缺血缺氧，破壞血腦屏障通透性，造成腦組織水腫，最終導(dǎo)致缺血性壞死。缺血性腦血管病目前尚無特效療法，臨床上通常采用溶栓或機(jī)械性碎栓進(jìn)行治療，可有效減輕腦損傷，但由于“時間窗”等因素限制，以及溶栓后血流再灌注容易引起腦出血等并發(fā)癥，導(dǎo)致病情惡化，損傷加重[11-12]。本研究成功建立局灶性腦缺血再灌注模型，實(shí)驗(yàn)過程中假手術(shù)組各項(xiàng)指標(biāo)改變與空白組比較無明顯差異，證實(shí)造模手術(shù)方式對腦組織無明顯損傷。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣虛血瘀、腦脈阻滯是導(dǎo)致缺血性腦血管病的基本病機(jī)，因氣虛而致血瘀，致使經(jīng)脈瘀塞不通，血流不達(dá)于腦部，形成缺血性腦損傷[13]。采用益氣活血法可以從整體上改善和保護(hù)缺血引起的腦組織損傷，氣盛而脈絡(luò)通，使利腦之氣血供養(yǎng)得以恢復(fù)，從而發(fā)揮對腦組織的保護(hù)作用[14]。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，重用黃芪補(bǔ)氣，兼用少量活血化瘀藥配伍，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效，主治氣虛血瘀之中風(fēng)。血塞通主要成分為三七提取物，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)作用，可擴(kuò)張腦血管、增加血流量，改善缺血受損的腦組織。兩者聯(lián)合應(yīng)用有益氣活血功效，可加強(qiáng)益氣，去除瘀血，調(diào)和氣血，消除病因，從而改善患者臨床癥狀，發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究聯(lián)合組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、大腦含水量明顯降低，腦梗死體積明顯減小，提示采用補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合血塞通的益氣活血法治療缺血再灌注引起的腦損傷，效果明顯。研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血法可有效減輕小鼠肺缺血再灌注損傷，保護(hù)受損肺組織[15]。臨床研究顯示，益氣活血法可明顯改善缺血性腦卒中患者恢復(fù)期臨床癥狀及功能缺損，綜合療效顯著[16]。氣虛是中風(fēng)致病之根源，氣行則血行，氣滯則血滯，益氣則氣行，活血則瘀除。益氣活血，使氣血和暢，則腦府得養(yǎng)，神明自復(fù)。

細(xì)胞凋亡在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路參與細(xì)胞增殖分化，與缺血再灌注損傷關(guān)系密切。Wnt是一個富含半胱氨酸的脂質(zhì)修飾糖蛋白家族，Wnt3a可促進(jìn)細(xì)胞的分裂、加速分化增殖，是信號通路中重要的激活劑。β-catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖。GSK-3β是β-catenin上游的關(guān)鍵酶，通過對β-catenin磷酸化，維持其在細(xì)胞內(nèi)的低表達(dá)量。CyclinD1是β-catenin的下游靶基因，是細(xì)胞周期增殖信號的關(guān)鍵蛋白。無Wnt蛋白存的情況下，GSK-3β可使β-catenin在Axin中磷酸化，通過泛素化的方式被蛋白酶降解；存在Wnt蛋白時，其與受體Fre結(jié)合后激活Wnt/β-catenin 信號通路，GSK-3β 被磷酸化而失活，β-catenin的降解途徑被阻斷，導(dǎo)致其在胞漿累積而進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游CyclinD1，促進(jìn)細(xì)胞增殖或活化[17]。Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡的重要基因之一，可以抑制細(xì)胞凋亡，Bax為Bcl-2同源基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax常用來衡量細(xì)胞凋亡情況[18]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組大鼠腦組織Wnt3a mRNA、β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA及蛋白水平降低，GSK-3β mRNA及蛋白水平升高，Bcl-2/Bax升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路被激活，可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，有利于減輕大鼠腦組織缺血再灌注損傷。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活，可提高心肌細(xì)胞存活率，減輕心肌缺血再灌注損傷[19]。另有研究顯示，調(diào)節(jié)GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡促存活，可減輕缺血再灌注引起的肝損傷[20]。Wnt/β-catenin信號通路在缺血再灌注中發(fā)揮重要作用，與本研究結(jié)果一致，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路激活可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，有效減輕缺血再灌注引起的腦損傷。

綜上所述，血塞通聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯的益氣活血法對缺血再灌注大鼠有腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，從而減輕缺血再灌注引起的腦損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，可為臨床治療缺血性腦血管病提供理論參考。