廖小紅　張毅靖　唐洪梅　丘振文　羅丹冬　楊柳柳　楊麗娥　羅騫

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）21-2593-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.06

摘 要 目的：研究葦莖湯對慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）模型大鼠的改善作用及可能機制。方法：將55只雄性SD大鼠按隨機數字表法隨機分為正常組，模型組，葦莖湯低、高劑量組（8.37、16.74 g/kg，以生藥量計）和地塞米松組（陽性對照組，0.09 mg/kg），每組11只。除正常組外，其余各組大鼠均采用香煙聯合脂多糖誘導的方法建立AECOPD模型。造模結束后，正常組和模型組大鼠灌胃水，其余各組大鼠灌胃相應藥物，每天灌胃2次，連續(xù)14 d。末次灌胃后，測定大鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）水平，觀察大鼠肺組織和支氣管的病理學變化，測定大鼠肺組織中基質金屬蛋白酶9 （MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1） mRNA表達水平及Ras同源基因家族成員A（RhoA）、蓬亂蛋白相關形態(tài)形成活化因子1（DAAM1）和細胞增殖抑制基因（HSG）蛋白的表達水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平以及肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平和RhoA、DAAM1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），肺組織中HSG蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）;支氣管周圍有較多慢性炎癥細胞浸潤，部分氣道黏膜上皮脫落;肺泡代償性擴張，肺間隔毛細血管擴張、充血。與模型組比較，葦莖湯高劑量組大鼠血清中IL-1β水平和肺組織中MMP-9 、TIMP-1 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）;葦莖湯低、高劑量組大鼠肺組織中RhoA、DAAM1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），HSG蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;葦莖湯高劑量組大鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤、氣道黏膜脫落等病理形態(tài)學變化均得到明顯改善，肺泡上皮結構較完整、未見明顯肺擴張。結論：葦莖湯對AECOPD模型大鼠具有一定的改善作用;其機制可能與下調肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA和RhoA、DAAM1蛋白的表達，上調肺組織中HSG蛋白的表達，從而抑制氣道重建有關。

關鍵詞 慢性阻塞性肺疾病急性加重期;葦莖湯;細胞增殖抑制基因;Wnt信號通路;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of Weijing decoction on AECOPD model rats and its possibile mechanism. METHODS：Totally 55 male SD rats were randomly divided into normal group， model group， Weijing decoction low-dose and high-dose groups （8.37， 16.74 g/kg， by crude drug），dexamethasone group （positive control group，0.09 mg/kg），with 11 rats in each group. Except for normal group， AECOPD model was induced by cigarettes combined with lipopolysaccharide in other groups. After modeling， normal group and model group were given constant volume of water intragastrically，and other groups were given relevant medicine intragastrocally，twice a day，for 14 days. After last intragastric administration， the serum level of IL-1β was determined， and pathological changes of lung tissue and bronchus were observed in each group; mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 genes in lung tissue were detected; protein expression of Ras homologous gene family member （RhoA），dishevelled associated activator of morphogenesis-1 （DAAM1） and hyperplasic suppress gene （HSG） in lung tissue were also determined. RESULTS： Compared with normal group， the levels of IL-1β in serum， mRNA expression of? MMP-9 and TIMP-1 as well as protein expression of RhoA and DAAM1 in lung tissue were increased significantly in the model group （P<0.05）， while protein expression of HSG in lung tissue was decreased significantly （P<0.05）;there were many chronic inflammatory cells infiltrating around the bronchus，some airway mucosa epithelium exfoliating，alveolar compensatory dilation，pulmonary septal capillary dilation and hyperemia. Compared with model group， the levels of IL-1β in serum， mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue were decreased significantly in Weijing decoction high-dose group （P<0.05）; the protein expression of RhoA and DAAM1 in lung tissue were decreased significantly in Weijing decoction low-dose and high-dose groups （P<0.05），while the protein expression of HSG in lung tissue was increased （P<0.05）; the pathological changes of Weijing decoction high-dose group， such as inflammatory cells infiltrating around the bronchus and shedding of airway mucosa， were improved significantly， and there was complete alveolar epithelium structure but no obvious pulmonary dilation. CONCLUSIONS： Weijing decoction can improve AECOPD model rats to certain extent; its mechanism may be associated with down-regulating mRNA expression of MMP-9 and TIMP-1 as well as protein expression of RhoA and DAAM1 in lung tissue， up-regulating protein expression of HSG in lung tissue so as to inhibit the airway remodeling.

KEYWORDS? ?Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease; Weijing decoction; Hyperplasic suppress gene; Wnt signaling pathway;Rat

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以肺功能障礙和持續(xù)的氣流受限為特征的阻塞性肺疾病，主要癥狀為咳嗽和呼吸困難[1]。在COPD 病程進展中，氣道重建是關鍵，其實質是小氣道成纖維細胞的增生[2]。COPD的發(fā)生與長期吸煙和吸入灰塵、毒素等因素相關[3-4]，其中長期吸煙是COPD的主要誘因，大部分COPD患者都有較長的吸煙史[5-6]。COPD分為穩(wěn)定期和急性加重期（AECOPD），AECOPD患者的呼吸系統癥狀加重且明顯高于日常水平，此時亟待調整臨床治療方案[7]。

葦莖湯出自唐代方書《外臺秘要》，由葦莖、冬瓜子、薏苡仁和桃仁等4味中藥材組成，具有清臟腑熱、清肺化痰、逐瘀排膿的功效，主要用于治療熱毒壅肺、痰瘀互結所致的肺癰，是中醫(yī)臨床上常用的清肺熱劑，對肺膿腫、大葉性肺炎和支氣管炎等呼吸道疾病均有較好的療效[8-10]。AECOPD以標實為主，凡是臨床辨證有痰熱瘀證候者即可選用葦莖湯消除膿痰[11-12]。相關研究表明，葦莖湯對AECOPD患者具有顯著療效[13-14]，但其具體作用機制尚不清楚。另有研究表明，促進細胞增殖抑制基因（HSG）的高表達或抑制Wnt /平面細胞極性（PCP）信號通路的激活有可能成為抑制氣道重建的突破點[2，15]。鑒于此，本研究擬建立AECOPD大鼠模型，并從HSG蛋白及Wnt/PCP信號通路角度探討葦莖湯治療AECOPD的分子機制，為臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有AL1240型千分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司），BGE-140型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司），MagNa Lyser型勻漿儀[羅氏診斷產品（上海）有限公司]，ZD-85型氣浴恒溫振蕩器（常州金壇精達儀器制造有限公司），5810R型臺式高速大容量離心機（德國Eppendorf公司），1510型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），ChemiDoc MP型全能型凝膠成像系統、165-8001型垂直板電泳槽（美國Bio-Rad公司），TS-2型水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），塑料煙熏箱（自制，規(guī)格為120 cm×120 cm×120 cm）。

1.2 主要藥品與試劑

葦莖飲片（批號2006001）購自佛山嶺南中藥飲片有限公司;冬瓜子飲片（批號200301）、薏苡仁飲片（批號200601）均購自廣東杏林藥業(yè)有限公司;桃仁飲片（批號200300831）購自普寧市康美藥業(yè)股份有限公司。以上飲片由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部丘振文主任中藥師鑒定均為真品。

醋酸地塞米松片（批號20092661，規(guī)格0.75 mg）購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限公司;0.9%氯化鈉溶液（批號C20L032，規(guī)格10 mL ∶ 90 mg）購自山東華魯制藥有限公司;紅雙喜牌香煙購自上海煙草集團有限責任公司上海卷煙廠;兔源HSG、蓬亂蛋白相關形態(tài)形成活化因子（DAAM1）、Ras同源基因家族成員A（RhoA）、β-肌動蛋白（β-actin）的多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自美國Proteintech公司;十二烷基硫酸鈉（SDS）配膠試劑盒（批號V900483）購自合肥白鯊生物科技有限公司;白細胞介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（批號GR2020-09）購自武漢基因美生物科技有限公司;Trizol試劑（批號DP424）購自北京天根生化科技有限公司;逆轉錄試劑盒（批號DBI-2220）購自德國DBI公司;熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測試劑盒（批號AOPR- 1200）購自上海基點生物科技有限公司;脂多糖（批號20200106）購自廣州欣勵和生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號FD2001）購自杭州弗德生物有限公司;水為蒸餾水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SPF級雄性SD大鼠，4周齡，體質量為（100±10） g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2018-0092。大鼠購入后飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境的晝夜節(jié)律為12 h/12 h、溫度為（24±2） ℃、相對濕度為55%～68%，飼養(yǎng)期間大鼠自由進食、飲水。本實驗嚴格遵守實驗動物福利倫理原則，實驗方案通過廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核（倫理審查編號為TCMF1-2020013）。

2 方法與結果

2.1 葦莖湯煎液的制備

取葦莖30 g、薏苡仁30 g、冬瓜子24 g、桃仁9 g，加10倍量（mL/g，下同）水浸泡1 h，然后再煎煮1 h，收集煎液;藥渣再次加8倍量水煎煮0.5 h，收集煎液;合并2次煎液，濃縮制備成含生藥量分別為8.37、16.74 g/kg的藥液。

2.2 動物分組、造模與給藥

將55只大鼠先適應性喂養(yǎng)7 d，然后按隨機數字表法隨機分為正常組，模型組，葦莖湯低、高劑量組（8.37、16.74 g/kg，以生藥量計，分別為1、2倍臨床等效劑量），地塞米松組（陽性對照組，0.09 mg/kg）[16]，每組11只。除正常組外，其余各組大鼠均采用香煙聯合脂多糖誘導的方法復制AECOPD模型[17-18]：煙熏箱用棉被堵住縫隙，每次熏煙20支，大鼠每天吸煙2次，每次持續(xù)1 h;分別于煙熏的第7、14、21天，于大鼠氣管注射脂多糖1 mg/kg（注射脂多糖當天不進行煙熏），造模共持續(xù)8周。正常組大鼠于實驗第7、14、21天氣管注射等量0.9%氯化鈉溶液。造模結束后，每組各取1只大鼠進行病理切片檢查：若造模大鼠的支氣管周圍出現較多慢性炎癥細胞浸潤、部分氣道黏膜上皮脫落，肺組織出現肺泡代償性擴張、肺泡壁變薄斷裂、肺大泡形成以及肺間隔毛細血管擴張、充血等現象，則表明AECOPD模型建立成功[18]。確定造模成功后，正常組和模型組大鼠灌胃水（10 mL/kg），其余各組大鼠灌胃相應藥物（10 mL/kg），每天灌胃2次（9：00和15：00各1次），連續(xù)灌胃14 d。

2.3 一般情況觀察

實驗期間觀察大鼠的一般情況，包括大鼠的活動、精神狀況、毛發(fā)光澤度、體質量變化等。

2.4 取材及處理

末次灌胃2 h后，以5%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，于腹主動脈采血。將血液靜置2 h，然后在4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，收集血清，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。采血后，立即處死并解剖大鼠，取其右肺組織和右支氣管，用生理鹽水清洗干凈;將一部分肺組織和支氣管固定在10%甲醛溶液中，將另一部分肺組織凍存于-80 ℃冰箱中。

2.5 血清中IL-1β水平測定

取“2.4”項下凍存的大鼠血清樣品，常規(guī)解凍后，采用ELISA法檢測血清中IL-1β水平。具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書方法進行，采用酶標儀進行測定。

2.6 肺組織和支氣管的病理形態(tài)學觀察

取10%甲醛溶液中固定24 h以上的大鼠肺組織和支氣管，常規(guī)制作石蠟切片（厚度均為3 μm）后，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，然后通過顯微鏡觀察肺組織和支氣管的病理形態(tài)學變化。

2.7 肺組織中基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1） mRNA表達水平測定

采用熒光定量PCR法進行測定。取“2.4”項下凍存的大鼠肺組織，常規(guī)解凍后，采用Trizol法提取組織中總RNA;檢測總RNA的濃度和純度后，按照逆轉錄試劑盒說明書方法操作將其逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性 10 s，55 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。反應體系（總體積為20.0 μL）包括：2× All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，上、下游引物（2 μmol/L） 各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平。PCR引物由廣州四和生物科技股份有限公司設計并合成，引物序列及擴增產物長度見表1。

2.8 肺組織中RhoA、DAAM1、HSG蛋白表達水平測定

采用Western blot法進行測定，每組選取3只大鼠的樣本進行實驗。取“2.4”項下凍存的大鼠肺組織，常規(guī)解凍后，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取組織中總蛋白，按照BCA試劑盒方法測定總蛋白的濃度后，以95 ℃加熱10 min使蛋白變性。取變性后總蛋白40 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V，電泳時間60 min），電泳結束后濕法轉移（電流200 mA，轉膜時間1 h）至聚偏二氟乙烯膜;用5%脫脂牛奶（以0.5%TBST制備）封閉液封閉20 min后，加入TBST洗膜3次、每次5 min;分別加入RhoA一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000）、DAAM1一抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000）、HSG一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000）以及內參β-actin一抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次、每次5 min，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋比例均為 1 ∶ 2 000），室溫孵育1 h;滴加ECL發(fā)光液，曝光，采用顯影、定影試劑進行顯影。采用Image J 1.8.0軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.9 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 一般情況觀察結果

自造模第17天起，各造模組大鼠的毛發(fā)開始出現光澤黯淡、油膩等現象，且伴有輕微的弓背扎堆和瞇眼癥狀;自造模第30天起，各造模組大鼠的反應開始變得遲鈍，飼料消耗速度開始減慢;自造模第8周起，上述癥狀均加重，但無其他新的異常表現。正常組大鼠在整個造模期間均反應敏捷、毛發(fā)正常。灌胃給藥結束后，葦莖湯高劑量組和地塞米松組大鼠的毛發(fā)光澤度、弓背扎堆等癥狀均有明顯改善，但葦莖湯低劑量組大鼠上述癥狀改善不明顯。

3.2 血清中IL-1β水平測定結果

與正常組[（43.46±3.10） ng/mL]比較，模型組大鼠血清中IL-1β水平[（51.77±10.34） ng/mL]顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，葦莖湯高劑量組和地塞米松組大鼠血清中IL-1β水平[（44.06±2.20）、（47.65±6.46）? ng/mL]均顯著降低（P<0.05），葦莖湯低劑量組大鼠血清中IL-1β水平[（48.29±4.88） ng/mL]差異無統計學意義（P>0.05）。

3.3 肺組織和支氣管病理形態(tài)學觀察結果

3.3.1 肺組織 正常組大鼠肺泡上皮結構完整，未見肺擴張。與正常組比較，模型組大鼠肺泡管囊狀擴張，肺泡膨大，肺泡壁變薄、斷裂并融合成為肺大泡。葦莖湯低劑量組大鼠肺泡管部分呈囊性擴張，部分肺泡膨大、肺泡壁變薄。葦莖湯高劑量組和地塞米松組大鼠肺泡上皮結構較完整，未見明顯肺擴張。各組大鼠肺組織病理形態(tài)學顯微圖見圖1。

3.3.2 支氣管 正常組大鼠支氣管黏膜上皮未見脫落，纖毛排列整齊，管壁周圍未見炎癥細胞。與正常組比較，模型組大鼠氣管黏膜上皮部分脫落，管壁有以淋巴細胞、漿細胞為主的炎癥細胞浸潤;支氣管黏膜皺壁顯著增多、變長，突入管腔;小動脈血管平滑肌顯著增生，管腔明顯狹窄;終末細支氣管遠端狹窄。葦莖湯低劑量組大鼠氣管黏膜上皮部分脫落，管壁可見少量以淋巴細胞、漿細胞為主的炎癥細胞浸潤;支氣管黏膜皺壁輕度增多、變長，突入管腔;呼吸性細支氣管及肺泡管部分呈囊性擴張。葦莖湯高劑量組和地塞米松組大鼠氣管黏膜上皮未見明顯脫落，纖毛排列較整齊，管壁周圍未見明顯炎癥細胞浸潤。各組大鼠支氣管病理形態(tài)學顯微圖見圖2。

3.4 肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平測定結果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，葦莖湯高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平測定結果見表2。

3.5 肺組織中RhoA、DAAM1、HSG蛋白表達水平測定結果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中RhoA、DAAM1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），HSG蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，葦莖湯低、高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織中RhoA、DAAM1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），HSG蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠肺組織中RhoA、DAAM1、HSG蛋白表達的電泳圖見圖3，蛋白表達水平測定結果見表3。

4 討論

COPD通常與肺部的炎癥反應相關，其病理變化包括慢性支氣管炎、氣道重建、肺動脈重建、肺氣腫等[19]。目前主要是采用抗炎、平喘、化痰等方法對AECOPD進行治療。因地塞米松對AECOPD具有較好的治療效果[20-21]，因此本研究以其作為陽性對照藥物。

AECOPD的發(fā)病與各種細胞因子介導的肺部炎癥反應密切相關。IL-1β為重要炎癥細胞因子，血清中IL-1β水平的變化對臨床判斷AECOPD的發(fā)生和預后具有重要作用[22]。本研究結果顯示，高劑量葦莖湯可顯著降低AECOPD模型大鼠血清中IL-1β水平，并可減少其支氣管黏膜上皮脫落、支氣管周圍炎癥細胞浸潤和肺大泡數量。以上結果表明，高劑量葦莖湯可通過降低機體的炎癥水平從而對AECOPD起到一定的改善作用。

相關研究顯示，MMP-9在COPD患者血清中表達上調，其可能參與并影響了COPD的病情進展[23]。MMP-9主要是通過破壞肺泡的基質成分，使肺泡腔擴大、肺泡彈性回縮能力減弱，從而導致氣流滯留，引發(fā)肺氣腫;此外，MMP-9還可通過介導炎癥細胞聚集，破壞上皮和內皮結構，從而參與氣道的炎癥反應和組織重建[24]。金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）能抑制MMPs的活性，且其中以TIMP-1的活性最強[25]。相關研究表明，血清中MMP-9、TIMP-1水平高低與COPD病情的嚴重程度相關，血清中MMP-9、TIMP-1水平越高表明COPD的病情越重[24]。本研究結果顯示，高劑量葦莖湯可顯著降低AECOPD模型大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平，這說明葦莖湯可通過下調肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達從而對AECOPD起到一定的改善作用。

趙克蟬等[26]在關于HSG與COPD中醫(yī)證型相關性的研究中發(fā)現，HSG在AECOPD患者血液中呈低表達，在正?；颊哐褐谐矢弑磉_;并認為HSG的高表達可能影響了氣道重建，與AECOPD病程可能存在著內在關聯。氣道重建的病理改變過程和肺血管重建極為相似，其中平滑肌細胞的收縮、增殖和凋亡都是氣道重建形成的主要原因[27]。相關研究表明，RhoA、DAAM1是Wnt/PCP信號通路中2個關鍵信號蛋白[19]。其中，RhoA主要通過調控微絲的重組來參與細胞的增殖、遷移和凋亡等過程[28]，進而影響氣道重建。DAAM l是形成素蛋白家族的一個成員，具有形成素蛋白家族的性質，是Wnt/PCP信號通路核心成員之一;其可通過激活RhoA、細胞分裂周期因子42等來調節(jié)細胞的收縮、增殖等功能，進而影響氣道重建[19，29]。本研究結果顯示，低、高劑量的葦莖湯均可顯著上調AECOPD模型大鼠肺組織中HSG蛋白的表達，下調肺組織中RhoA和DAAM1蛋白的表達，這提示葦莖湯可在一定程度上抑制AECOPD模型大鼠的氣道重建。

綜上所述，葦莖湯對AECOPD模型大鼠具有一定的改善作用;其機制可能與下調肺組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA和RhoA、DAAM1蛋白的表達，上調肺組織中HSG蛋白的表達，從而抑制氣道重建有關。

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（收稿日期：2021-05-27 修回日期：2021-09-15）

（編輯：林 靜）