鄭翔宇，付宗強(qiáng)，張艷敏，郭偉勝

0 引 言

糖尿病是全球范圍內(nèi)的常見疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。糖尿病以高血糖、葡萄糖不耐受等為特征，臨床上以血糖增高為診斷特點(diǎn)，同時(shí)糖尿病還常伴隨有脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝紊亂等病理特征，也有很多學(xué)者將糖尿病稱之為“糖脂病”[1]。研究顯示，胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生的重要原因，也是當(dāng)前體外模擬糖尿病常用的模型[2]。lncRNA是長度超過200核苷酸的非編碼RNA，其在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，如：介導(dǎo)基因沉默、基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯、基因修飾等；lncRNA的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其能夠通過影響下游基因的表達(dá)發(fā)揮多種生物學(xué)作用[3]。lncRNA NONRATT021972是近些年來研究發(fā)現(xiàn)的與人體正常生理活動(dòng)和病理進(jìn)展有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，其參與心肌缺血星狀神經(jīng)節(jié)病理過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，NONRATT021972在糖尿病中表達(dá)上調(diào)，且下調(diào)NONRATT021972減輕2型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛[5]。下調(diào)NONRATT021972還能夠改善糖尿病引起的神經(jīng)節(jié)心率變異[6]。目前NONRATT021972在胰島β細(xì)胞中的相關(guān)研究較少。本研究探討下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性(高脂高糖)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖和炎癥因子表達(dá)影響，為分子靶向治療糖尿病提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料胰島β細(xì)胞NIT-1購自武漢普諾賽生物科技有限公司；山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗、兔抗C-Caspase-3抗體、兔抗TLR4抗體購自齊一生物科技(上海)有限公司；NONRATT021972 shRNA、shRNA control、TLR4過表達(dá)載體(pcDNA-TLR4)、空載體(pcDNA)均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司構(gòu)建；兔抗C-Caspase-9抗體購自美國Abbkine；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser購自大連Takara。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將胰島β細(xì)胞培養(yǎng)在含有15%胎牛血清、25 mmol/L葡萄糖、0.25 mmol/L棕櫚酸的DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞每2天更換一次培養(yǎng)液，融合率為80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期的胰島β細(xì)胞分成對照組(正常培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞)、模型組(用25 mmol/L葡萄糖、0.25 mmol/L棕櫚酸的細(xì)胞培養(yǎng)液處理)、sh-NC組(轉(zhuǎn)染shRNA control，然后用25 mmol/L葡萄糖、0.25 mmol/L棕櫚酸處理細(xì)胞)、sh-NONRATT021972組(轉(zhuǎn)染sh-NONRATT021972，然后用25 mmol/L葡萄糖、0.25 mmol/L棕櫚酸處理細(xì)胞)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將稀釋12.5 μL shRNA control、NONRATT021972 shRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.1Realtime PCR方法檢測NONRATT021972、TLR4和TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，分別在細(xì)胞內(nèi)添加RNAiso plus將細(xì)胞內(nèi)的總RNA提取，以RNase free ddH2O溶解RNA，充分混混合，吸取1 μL的RNA溶液至超微量紫外分光光度計(jì)，檢測得到的A260/A280的比值在1.7～2.1。利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取1 μg的RNA，分別與2 μL的5×gDNA Eraser Buffer、1 μL的gDNA Eraser充分混合，用RNase free ddH2O將體積補(bǔ)足至10 μL，置于PCR儀內(nèi)，設(shè)置42 ℃反應(yīng)2 min，4 ℃冷卻，繼續(xù)在上述體系內(nèi)添加1 μL的PrimeScript RT Enzyme mix I、1 μL的RT primer mix、4 μL的5×PrimeScript Buffer，最后以RNase free ddH2O將體積補(bǔ)足至20 μL，放在PCR儀內(nèi)，設(shè)置37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，4 ℃保存，將得到的cDNA放在-20 ℃保存。以TB green premix Ex Taq II配制PCR反應(yīng)體系，包括10 μL的TB Green Premix Ex Taq II、0.4 μL的ROX Reference Dye II、0.8 μL的上游和下游引物，最后用ddH2O將體積補(bǔ)足至20 μL，PCR的反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃ 30 s(1個(gè)循環(huán))；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s(40個(gè)循環(huán))，結(jié)果以GAPDH作為參照，分析目的基因的表達(dá)變化(按照2-△△Ct法)。PCR引物序列為：NONRATT021972上游 5′-TTAGGAGCAGTACGGTTCA-3′和下游5′-GGAGTACGTGCTGTGAAG-3′；TNF-α上游 5′-CTTCTCCTTCCTGATCGTGG-3′和下游5′-GCTGGTTATCTCTCAGCTCCA-3′；IL-6上游 5′-GGAGACTTGCCTGGTGAAAA-3′和下游5′-GTCAGGGGTGGTTATTGCAT -3′；IL-1β上游 5′-GGCCCTAAACAGATGAAGTG-3′和下游5′-GTAGTGGTGGTCGGAGATTC-3′；GAPDH上游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′和下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性變化胰島β細(xì)胞種植到96孔板中，每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量相同，均為105個(gè)/孔，每孔內(nèi)添加100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，按照對照組、模型組、sh-NC組、sh-NONRATT021972組處理方法處理細(xì)胞，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h以后，取出培養(yǎng)板，分別在每個(gè)孔中添加10 μL的CCK-8溶液，檢測570 nm的吸光度(A)值，A值表示細(xì)胞增殖活性變化。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，在細(xì)胞中添加PBS溶液，將細(xì)胞洗滌2次，1000g離心5 min。用Binding Buffer溶液將細(xì)胞懸浮，此時(shí)細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL。吸取100 μL的細(xì)胞懸浮液，添加5 μL的膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)溶液，在室溫中孵育結(jié)合15 min。繼續(xù)添加2 mL的Binding Buffer將細(xì)胞洗滌1次，用400 μL的Binding Buffer將細(xì)胞懸浮。添加5 μL的PI染料，在室溫中反應(yīng)10 min。在1 h內(nèi)立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.2.4Western blot檢測C-Caspase-3、C-Caspase-9、TLR4、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，收集細(xì)胞，分別在細(xì)胞內(nèi)添加含有0.1%體積PMSF的裂解溶液，在搖床冰上孵育30min，以細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集，然后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以4 ℃，12 000g離心10 min。將上清溶液吸取，放在-80 ℃保存。按照BCA方法檢測提取蛋白樣品的濃度。制備10%的下層分離膠和5%的上層濃縮膠，常規(guī)方法配制SDS-PAGE凝膠。取出蛋白樣品，與Loading Buffer混合后，放在100 ℃煮沸5 min。吸取蛋白樣品至SDS-PAGE凝膠上樣孔內(nèi)，首先設(shè)置70 V的電壓電泳，肉眼觀察到染料剛剛進(jìn)入下層膠時(shí)，將電壓設(shè)置為100V繼續(xù)電泳，等到染料已經(jīng)進(jìn)入玻璃板的底部以后，將凝膠取出，浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將NC膜裁剪，然后以90 V的電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h。NC膜放在含有5%牛血清白蛋白平皿內(nèi)，室溫結(jié)合2 h。NC膜置于含有一抗溶液的平皿內(nèi)，在室溫孵育2 h。NC膜放在含有1 ∶ 2000稀釋以后的山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗平皿內(nèi)，在室溫結(jié)合2 h。用ECL顯色。分析條帶的灰度值，根據(jù)灰度值以GAPDH作為參照，分析目的蛋白的表達(dá)變化。兔抗C-Caspase-3、兔抗C-Caspase-9、TNF-α、IL-6、IL-1β抗體按照1 ∶ 800稀釋，兔抗TLR4抗體按照1 ∶ 1000稀釋。

1.3TLR4過表達(dá)載體對下調(diào)NONRATT021972影響胰島β細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子表達(dá)的作用在胰島β細(xì)胞中分別將NONRATT021972 shRNA、陰性對照載體和NONRATT021972 shRNA、TLR4過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，用含有25mmol/L葡萄糖、0.25mmol/L棕櫚酸的細(xì)胞培養(yǎng)液處理，記為sh-NONRATT021972+NC組和sh-NONRATT021972+TLR4組，Realtime PCR方法檢測TLR4、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化，Western blot檢測C-Caspase-3、C-Caspase-9、TLR4、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 NONRATT021972 shRNA對糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中NONRATT021972表達(dá)的影響與對照組胰島β細(xì)胞中NONRATT021972表達(dá)水平(1.00±0.11)比較，模型組(2.47±0.12)明顯升高(P<0.001)；與sh-NC組NONRATT021972表達(dá)水平(2.45±0.23)比較，sh-NONRATT021972組(1.12±0.16)明顯降低(P<0.001)。說明NONRATT021972 shRNA下調(diào)糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中NONRATT021972表達(dá)水平。

2.2下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖和凋亡影響與對照組比較，模型組胰島β細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；與sh-NC組比較，sh-NONRATT021972組胰島β細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。說明下調(diào)NONRATT021972提高糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞凋亡。見圖1、圖2，表1。

2.3下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥因子表達(dá)影響與對照組比較，模型組胰島β細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白水平增多(P<0.05)；與sh-NC組比較，sh-NONRATT021972組胰島β細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白水平減少(P<0.05)。下調(diào)NONRATT021972減少糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)。見表2，圖3。

1:對照組； 2：模型組； 3：sh-NC組； 4：sh-NONRATT021972組

表 1 下調(diào)NONRATT021972后糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平

表 2 下調(diào)NONRATT021972后糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中炎癥因子mRNA和蛋白水平

1:對照組； 2：模型組； 3：sh-NC組； 4：sh-NONRATT021972組

2.4下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中TLR4表達(dá)影響與對照組胰島β細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白水平比較，模型組明顯增多(P<0.05)；與sh-NC組胰島β細(xì)胞、TLR4 mRNA和蛋白比較，sh-NONRATT021972組明顯減少(P<0.05)。下調(diào)NONRATT021972減少糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中TLR4表達(dá)。見圖4，表3。

2.5TLR4過表達(dá)載體對下調(diào)NONRATT021972的胰島β細(xì)胞中TLR4表達(dá)影響與sh-NONRATT021972+NC組比較，sh-NONRATT021972+TLR4組胰島β細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。見圖5，表4。

1:對照組； 2：模型組； 3：sh-NC組； 4：sh-NONRATT021972組

表 3 下調(diào)NONRATT021972后糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中TLR4水平

1：sh-NONRATT021972+NC組； 2：sh-NONRATT021972+TLR4組

表 4 TLR4過表達(dá)載體和NONRATT021972 shRNA共轉(zhuǎn)染后糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞中TLR4蛋白水平

2.6TLR4對下調(diào)NONRATT021972影響胰島β細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子表達(dá)的作用與sh-NONRATT021972+NC組比較，sh-NONRATT021972+TLR4組胰島β細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖6、圖7，表5。

圖 6 上調(diào)TLR4和下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響

1：sh-NONRATT021972+NC組； 2：sh-NONRATT021972+TLR4組

表 5 下調(diào)NONRATT021972后糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中蛋白水平及mRNA水平

3 討 論

糖尿病是常見的慢病疾病，慢性炎癥是糖尿病進(jìn)展的重要原因之一[7]。研究顯示，胰島β細(xì)胞受到高脂高糖刺激以后，其增殖活性降低，同時(shí)還能夠產(chǎn)生大量的炎癥因子，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。TNF-α、IL-6、IL-1β是常見的促炎因子，其在糖尿病患者體內(nèi)高表達(dá)[9]。研究顯示，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控因子的表達(dá)有關(guān)，這些基因共同影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程[10]。含半胱氨酸的Caspase蛋白家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，其蛋白成員較多，正常情況下，Caspase蛋白家族成員多以沒有活性的酶原形式存在，只有被激活后才可以形成凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終激活細(xì)胞凋亡[11]。根據(jù)在Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的作用，Caspase蛋白家族成員分成凋亡起始因子、執(zhí)行因子等，Caspase-9是位于Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)上游的起始因子，Caspase-3是位于Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游的執(zhí)行因子，兩者活化后加速細(xì)胞凋亡[12-14]。本研究結(jié)果顯示，糖脂毒性處理后的胰島β細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白水平升高，C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)增多，糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，加速細(xì)胞凋亡，這與既往研究報(bào)道[9-10]一致，表明構(gòu)建了體外糖脂毒性胰島β細(xì)胞模型。

非編碼RNA是廣泛存在生命機(jī)體內(nèi)的調(diào)控因子，其最初被認(rèn)為是沒有生物學(xué)作用的轉(zhuǎn)錄“噪音”，后續(xù)發(fā)現(xiàn)非編碼RNA通過復(fù)雜作用影響人類多種疾病如高血壓、心力衰竭、腫瘤等的發(fā)生[15-17]。在糖尿病進(jìn)展中已經(jīng)證明lncRNA具有重要作用，lncRNA調(diào)控糖尿病進(jìn)展程度，lncRNA可能是未來糖尿病治療的分子靶點(diǎn)[18]。NONRATT021972是近些年來發(fā)現(xiàn)的與糖尿病有關(guān)的調(diào)控因子，NONRATT021972在糖尿病進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)NONRATT021972降低糖尿病引起的神經(jīng)病理性疼痛，改善神經(jīng)節(jié)心率變異[5-6,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NONRATT021972后的胰島β細(xì)胞增殖活性明顯升高，細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡程度降低，細(xì)胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表達(dá)減少，提示下調(diào)NONRATT021972能夠改善糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，下調(diào)NONRATT021972對糖尿病胰島β細(xì)胞損傷可能具有改善作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞中TLR4mRNA和蛋白表達(dá)增多，而下調(diào)NONRATT021972可以減少TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)，NONRATT021972作用機(jī)制可能與TLR4有關(guān)。TLR4屬于Toll樣受體家族，TLR4在人體內(nèi)的作用極為重要，其參與炎癥、細(xì)胞凋亡、能量代謝等過程[20]。在糖尿病中發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)水平上調(diào)，下調(diào)TLR4改善糖尿病誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷[21-22]。本次研究采用共轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)TLR4能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)NONRATT021972對糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡影響，提示下調(diào)NONRATT021972通過降低TLR4的表達(dá)改善糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷。

綜上所述，下調(diào)NONRATT021972通過降低TLR4的表達(dá)減少糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞增殖活性，NONRATT021972可能是未來糖尿病治療的分子靶點(diǎn)。目前尚未分析NONRATT021972通過何種靶向機(jī)制影響TLR4進(jìn)而影響胰島β細(xì)胞，這部分內(nèi)容會(huì)在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。