任 虹，劉 娟，于桂泳，李 美

0 引 言

骨關(guān)節(jié)炎是中老年人中常見的骨關(guān)節(jié)性疾病，主要是由關(guān)節(jié)軟骨磨損遭到破壞產(chǎn)生的，軟骨細(xì)胞凋亡是其重要的病理因素[1]?，F(xiàn)有治療方式有針灸、按摩、推拿、運(yùn)動(dòng)等非藥物治療；鎮(zhèn)痛劑、維生素C、糖皮質(zhì)激素及軟骨保護(hù)劑等藥物治療；截骨術(shù)、關(guān)節(jié)融合等外科手術(shù)治療[2]。而中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎是一種更有效、成本更低、創(chuàng)傷更小的治療方法[3]。杜仲因其有抗炎和抗骨質(zhì)疏松等療效而常被用來治療骨傷科疾病，是一種重要的中藥材。杜仲苷是杜仲的主要成分， 研究發(fā)現(xiàn)杜仲苷可以提高體外炎性環(huán)境下大鼠軟骨細(xì)胞的增殖活力[4]。王勝楠等[5]研究發(fā)現(xiàn)杜仲苷能抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥、分解代謝、細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的表達(dá)。然而杜仲苷影響軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制尚未完全清楚。因此，本研究旨在研究杜仲苷對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑胎牛血清、DEME培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；RNA提取試劑盒、qPCR試劑盒(日本Takara公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8、蛋白提取試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天)。杜仲苷(HPLC≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendrof公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；FACS caliber流式細(xì)胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)；LightCycler480 熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche公司)。

1.2方法

1.2.1 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織由當(dāng)?shù)毓强漆t(yī)院提供，具體操作方法參考文獻(xiàn) [5]，無菌條件下切碎軟骨組織，0.15%的膠原酶充分消化，過22目細(xì)胞，400 g/min離心10 min，離心半徑10 cm，去上清。加入DEME培養(yǎng)液重懸，在37 ℃下培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期軟骨細(xì)胞，分別用終濃度為10、100、500、1000 μmol/L的杜仲苷處理，分別為杜仲苷10 μmol/L組、杜仲苷100 μmol/L組、杜仲苷500 μmol/L組、杜仲苷1000 μmol/L組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期軟骨細(xì)胞，無血清重懸后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-Prdx5組(轉(zhuǎn)染pcDNA-Prdx5 mimics)、杜仲苷+si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC后用500 μmol/L杜仲苷處理)、杜仲苷+si-Prdx5組(轉(zhuǎn)染si-Prdx5后用500 μmol/L杜仲苷處理)。

1.2.3qRT-PCR分析Bcl-2、Bax、Prdx5 mRNA表達(dá)水平提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min，終止反應(yīng)，冰上冷卻。按熒光定量PCR試劑盒說明操作，配置反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系20 μL(ddH2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR premix Ex-tap 10 μL)，然后進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃ 10 s、60℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，以β-actin為內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為參照計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5CCK-8法測(cè)定骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，反應(yīng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處A值，以A值指代細(xì)胞活性。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，漂洗后重懸細(xì)胞，加入500 μL的結(jié)合緩沖液混勻，然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較，隨著杜仲苷濃度的升高，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性逐漸升高(P<0.05)。表明杜仲苷可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖。但杜仲苷500 μmol/L組和杜仲苷1000 μmol/L組對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故選用濃度500 μmol/L杜仲苷(杜仲苷組)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與杜仲苷10 μmol/L組比較，#P<0.05；與杜仲苷100 μmol/L組比較，△P< 0.05

2.2杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，杜仲苷組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡率[(7.89±1.03)%]較對(duì)照組[(18.76±1.24)%]顯著降低(P<0.05)。表明杜仲苷可明顯抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖 2 杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

2.3杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，杜仲苷組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。表明杜仲苷可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)。見圖3，表1。

圖 3 杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表 1 杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Prdx5表達(dá)的影響qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，杜仲苷組Prdx5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。表明杜仲苷促進(jìn)Prdx5 mRNA和蛋白的表達(dá)。見圖4，表2。

圖 4 杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Prdx5蛋白表達(dá)的影響

表 2 杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Prdx5表達(dá)的影響

2.5Prdx5過表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA-Prdx5組Prdx5蛋白的表達(dá)水平顯著高于pcDNA組(P<0.05)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA-Prdx5組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性顯著高于pcDNA組(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA-Prdx5組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著低于pcDNA組(P<0.05)。可見，Prdx5過表達(dá)能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。見圖5、圖6，表3。

圖 5 Western blot檢測(cè) Prdx5蛋白的表達(dá)

圖 6 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)Prdx5過表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

表 3 Prdx5過表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6Prdx5抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組Prdx5蛋白的表達(dá)水平比較，杜仲苷組顯著升高(P<0.05)；與杜仲苷+si-NC組Prdx5蛋白的表達(dá)水平比較，杜仲苷+si-Prdx5組顯著降低(P<0.05)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性比較，杜仲苷組顯著升高(P<0.05)；與杜仲苷+si-NC組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性比較，杜仲苷+si-Prdx5組顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡率比較，杜仲苷組顯著降低(P<0.05)；與杜仲苷+si-NC組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡率比較，杜仲苷+si-Prdx5組顯著升高(P< 0.05)。表明Prdx5抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制的作用。見圖7、圖8，表4。

1:對(duì)照組； 2:杜仲苷組； 3:杜仲苷+si-NC組; 4:杜仲苷+si-Prdx5組

a:對(duì)照組； b:杜仲苷組； c:杜仲苷+si-NC組; d:杜仲苷+si-Prdx5組

表 4 Prdx5抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎病癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量[6-7]。尋求一種能夠較為徹底改善治療骨關(guān)節(jié)炎病的方式顯得尤為重要。近些年來關(guān)于中藥在關(guān)節(jié)炎上的應(yīng)用已有很多，杜仲是使用頻率較高的一種[8]。臨床上杜仲多用來治療高血壓、腰痛、關(guān)節(jié)炎等疾病[9]。王和鳴等[10]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方杜仲健骨顆粒能有效改善膝骨關(guān)節(jié)癥狀，用藥安全，無毒副作用。向開興等[11]發(fā)現(xiàn)杜仲靈仙湯對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療有較好的臨床效果。魯海等[12]研究發(fā)現(xiàn)杜仲可調(diào)節(jié)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎中MMPs和TIMPs的表達(dá)，能保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。崔永鋒等[13]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)服杜仲水煎液有利于兔子創(chuàng)傷性骨折的愈合。杜仲還能抑制蛋清所致大鼠的足腫脹，減輕小鼠的炎癥，有抗炎作用[14]。

Peroxiredoxins(Prdxs)是一類保護(hù)細(xì)胞，抵抗氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖的蛋白[15]。Prdx蛋白在清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧預(yù)防腫瘤同時(shí)又能清除腫瘤細(xì)胞中的活性氧而保護(hù)腫瘤[16]。Prdx5(Peroxiredoxin V)是過氧化物還原酶家族的成員之一，具有抗氧化作用，可作為乳腺癌的標(biāo)記基因[15]。Prdx5在人軟骨中組成型表達(dá)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中上調(diào)表達(dá)[17]。研究發(fā)現(xiàn)Prdx5可以瞬時(shí)抑制ISG54介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。Prdx5在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)，抑制Prdx5表達(dá)能通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路而抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡[19]。Prdx4過表達(dá)增加了ROS的產(chǎn)生，降低了Bcl-2，p-AKT的表達(dá)水平從而顯著降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[20]。Prdx5對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療具有重要價(jià)值。

杜仲對(duì)過氧化物酶有一定的影響，如杜仲雄花茶能提高小鼠中的SOD和GSH-Px等過氧化物酶的活性，有一定的抗氧化、抗衰老作用[21]。以杜仲作為主要成分之一的草藥可提高部分致癌物代謝酶的活性，抑制肝癌的發(fā)生[22]。此外，還可以通過一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)其功能。杜仲苷通過抑制NF-κB活化途徑抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎癥[23]。杜仲苷別名桃葉珊瑚苷，桃葉珊瑚苷可以通過清除ROS，下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)受損的HaCaT細(xì)胞[24]；桃葉珊瑚苷通過ROS/P38通路抑制HSF細(xì)胞凋亡[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲苷可以提高骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞凋亡，提高Prdx5的表達(dá)水平。Prdx5過表達(dá)可以提高骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞凋亡。Prdx5抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了杜仲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)和凋亡抑制作用。綜上所述，杜仲苷可以促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，其機(jī)制可能與Prdx5有關(guān)。