王天南,汪陽忠,劉 鴻,陳 敏,費 婷,吳 達

(上海煙草集團有限責任公司 技術(shù)中心,上海 201315)

煙草特有N-亞硝胺類化合物(TSNAs)是由煙草內(nèi)源性生物堿與硝酸鹽或亞硝酸鹽通過亞硝化作用產(chǎn)生的,其中研究較多的為N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和4-(N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)[1]。TSNAs是煙草及煙草制品中的重要致癌物質(zhì),會引起肺部、口腔、食道、胰臟、肝臟等部位形成腫瘤[2],其中NNK 和NNN 已被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為強致癌物[3]。電子煙又叫做電子煙堿傳送系統(tǒng),是一種新型煙草制品[4],由于其避免了傳統(tǒng)煙絲的燃燒過程,且煙液成分相對簡單,有害成分的釋放量與傳統(tǒng)卷煙相比大大減少[5]。但是,多數(shù)電子煙為了保持卷煙口感,會在煙液中添加煙草提取物,從而引入了TSNAs,因此有必要對電子煙煙液及其抽吸產(chǎn)生的氣溶膠中TSNAs含量進行測定[6-7]。

目前傳統(tǒng)卷煙主流煙氣中TSNAs的檢測方法已相對成熟,常用方法有氣相色譜-熱能分析法(GC-TEA)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10-11]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-16]等。GC-TEA 靈敏度高、選擇性強,但是不能有效區(qū)分TSNAs[13],且存在樣品純化步驟多,分析時間長等不足[14]。GC-MS一般用于分析TSNAs含量較高的煙葉、煙絲或煙氣樣品,無法滿足痕量TSNAs的檢測需求[13]。LC-MS/MS 具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點,逐漸成為測定傳統(tǒng)卷煙主流煙氣TSNAs的重要方法。但是由于電子煙煙液及氣溶膠中TSNAs含量極低,對方法的靈敏度要求較高,采用以上方法進行準確定量的難度較大。目前,相關(guān)檢測方法不僅報道的較少,而且分析對象主要為電子煙煙液,除此之外,還存在方法靈敏度較低,檢出限較高,前處理過程需要使用固相萃取小柱,操作繁瑣、耗時等問題[6-7,12,17]。鑒于此,本工作通過優(yōu)化抽吸口數(shù)、電子煙功率、萃取條件和色譜條件,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定電子煙煙液及氣溶膠中TSNAs含量的方法,方法穩(wěn)定性好、靈敏度高,可以滿足痕量TSNAs準確定量需求,可為電子煙產(chǎn)品中TSNAs含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考,對電子煙安全性評價具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 infinity 型高效液相色譜儀,配AB SCIEX QTRAP 5500 型三重四極桿質(zhì)譜檢測器;Milli-Q50型超純水制備儀;KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器(功率1 000 W);CP2245型電子天平(感量0.000 1 g);X500E型吸煙機。

一級混合標準溶液:取NNN、NAT、NAB 和NNK 標準品,用甲醇溶解并稀釋配制成1 mg·L－1的一級NNN、NAT、NAB 和NNK 混合標準溶液。

二級混合標準溶液:取適量1 mg·L－1的一級NNN、NAT、NAB 和NNK 混合標準溶液,用甲醇稀釋配制成10μg·L－1二級NNN、NAT、NAB 和NNK 混合標準溶液。

混合內(nèi)標儲備溶液:取適量NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4和NNK-d4的標準品,用甲醇溶解并稀釋配制成4 mg·L－1的NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4和NNK-d4混合內(nèi)標儲備溶液。

混合標準溶液系列:取二級混合標準溶液及混合內(nèi)標儲備溶液,用0.1 mol·L－1乙酸銨溶液逐級稀釋配制成0.010,0.025,0.050,0.10,0.25,0.50,2.5,5.0μg·L－1混合標準溶液系列,內(nèi)含10μg·L－1混合內(nèi)標溶液。

NNN、NAT、NAB、NNK 標準品的純度不小于98%;NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4標準 品的純度不小于99%。

甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純;甲酸銨、甲酸為質(zhì)譜純;試驗用水為超純水;電子煙液及煙具均為市售產(chǎn)品。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱溫60 ℃;流量0.3 mL·min－1;進樣量5 μL;流動相A為0.01 mol·L－1甲酸銨溶液;B為含0.025%(體積分數(shù),下同)甲酸的乙腈溶液;梯度洗脫程序:0～2.0 min時,A 為90%;2.0～4.0 min時,A 由90%降至60%;4.0～6.0 min時,A 由60%降為40%;6.0～8.0 min時,A 由40%降至10%;8.0～8.1 min時,A 由10%跳轉(zhuǎn)至90%;檢測時間10 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力241 kPa;電噴霧電壓3 000 V;輔助氣1 壓力414 kPa,輔助氣2 壓力448 kPa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;正離子掃描模式;離子對駐留監(jiān)測時間50 ms。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子對。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 電子煙煙液樣品

取1 g 電子煙煙液于50 mL 樣品瓶中,加入0.1 mol·L－1乙酸銨溶液20 mL 及4 mg·L－1混合內(nèi)標溶液50μL,超聲萃取30 min,經(jīng)0.2μm 聚四氟乙烯濾膜過濾,濾液按儀器工作條件測定。

1.3.2 電子煙氣溶膠樣品

采用國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)推薦的電子煙抽吸參數(shù),抽吸容量55 mL、抽吸頻率為每30 s抽吸一口、抽吸持續(xù)時間3 s[18]。可調(diào)功率電子煙在最大功率下進行抽吸試驗,每種品牌電子煙抽吸3支,將抽吸20口釋放的氣溶膠捕集在一張直徑為44 mm 劍橋濾片上,每支煙具收集2張濾片,置于50 mL 樣品瓶中,加入0.1 mol·L－1乙酸銨溶液20 mL 及4 mg·L－1混合內(nèi)標溶液50μL,超聲萃取30 min,經(jīng)0.2μm 聚四氟乙烯濾膜過濾,濾液按儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗比較了Proshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.7μm)和Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)對電子煙煙液及氣溶膠中4種TSNAs的分離效果。結(jié)果顯示:用Proshell 120 SB-C18色譜柱分離時,目標物的峰形欠佳,其中NNK 色譜峰容易出現(xiàn)分叉,NAT 色譜峰拖尾嚴重;在Eclipse Plus C18RRHD色譜柱上,4種TSNAs可達到有效分離,色譜峰峰寬較窄且峰形較好。因此,試驗選擇Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱作為分析柱。

試驗對流動相的組成進行了優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),以0.01 mol·L－1甲酸銨溶液作為水相時,色譜峰峰形可得到有效改善,峰寬變窄且峰形較好。以乙腈為有機相時,氣溶膠樣品中NNN 與雜質(zhì)未完全分離,而NAB 徹底被雜質(zhì)掩蓋。以含0.025%甲酸的乙腈溶液為有機相時,4種TSNAs可得到有效分離,峰形較不加酸時更加尖銳和對稱,其中NNN 及NAB 與相應(yīng)雜質(zhì)峰徹底分離。因此,試驗以含0.025%甲酸的乙腈溶液作為有機相。

試驗還考察了不同流動相流量(0.2,0.3,0.4,0.5 mL·min－1)和不同柱溫(30,40,50,60 ℃)對電子煙液及氣溶膠樣品中TSNAs分離效果的影響。結(jié)果顯示:當流量為0.3 mL·min－1時,NNN和NAB分離度最好,目標物峰形較好且峰寬較窄;隨著柱溫的升高,NNN 和NAB 的分離度逐漸提高。由于乙腈的沸點為81.6 ℃,考慮到溶劑的穩(wěn)定性,試驗選擇60 ℃作為分析柱溫,0.3 mL·min－1作為流動相流量。

2.2 萃取方式和萃取時間的選擇

以CORESTA 推薦的0.1 mol·L－1乙酸銨溶液作為萃取溶劑[19],對比了振蕩萃取和超聲萃取兩種萃取方式萃取電子煙煙液及氣溶膠樣品時的萃取效果。試驗發(fā)現(xiàn)兩種方式的萃取效果基本一致,考慮到振蕩萃取會導(dǎo)致劍橋濾片破碎溶解,不利于后續(xù)樣品處理,因此選擇超聲萃取方式。進一步考察了不同超聲萃取時間對電子煙煙液及氣溶膠樣品萃取效果的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 不同超聲萃取時間得到的電子煙煙液和氣溶膠中TSNAs的含量Fig.1 Contents of TSNAs in e-cigarette liquid and aerosol obtained with the different ultrasonic extraction time

由圖1可知:煙液中的4 種TSNAs含量在超聲萃取時間10 min時已達到平衡,氣溶膠中的在超聲萃取時間30 min時達到平衡,萃取時間均小于傳統(tǒng)振蕩萃取法(60 min)[19]。因此,試驗選擇以超聲萃取30 min來提取樣品中的TSNAs。

2.3 電子煙氣溶膠釋放穩(wěn)定性試驗

電子煙氣溶膠釋放穩(wěn)定性是評判電子煙質(zhì)量的一項重要指標,而氣溶膠的釋放量與電子煙種類及抽吸口數(shù)有關(guān)。試驗根據(jù)每20口抽吸產(chǎn)生氣溶膠捕集量(ACM20口)的不同選取了3款具有代表性的電子煙為待測對象,分別是:1＃自帶煙彈的一次性電子煙(ACM20口不大于100 mg);2＃不可調(diào)功率大煙(ACM20口為100～200 mg);3?？烧{(diào)功率大煙(ACM20口為200～300 mg)。每支煙總共抽吸100口,每間隔20口為一個單位,將所得氣溶膠粒相物捕集在一張濾片上,測定5 張濾片的ACM及TSNAs含量,并計算每張濾片不同抽吸口數(shù)(20,40,60,80及100)收集的電子煙氣溶膠ACM、4種TSNAs的測定值及總量,以及ACM 質(zhì)量和TSNAs總量的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2和圖2。

表2 以抽吸20口為一個單位時氣溶膠釋放穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of test for aerosol release stability with 20 puff numbers as a unit(n＝5)

圖2 不同抽吸口數(shù)所得氣溶膠ACM 及其中TSNAs含量Fig.2 Contents of ACM and TSNAs in aerosol with different puff numbers

由表2和圖2可知,對于不同類型的電子煙器具來說,抽吸同樣的電子煙煙液,每抽吸20口氣溶膠中4種TSNAs可實現(xiàn)準確定量,且隨著抽吸口數(shù)的增加,煙具1＃和煙具2＃電子煙氣溶膠ACM及TSNAs含量均隨之增加,且兩者呈正相關(guān)關(guān)系,煙具3＃氣溶膠ACM 及TSNAs先隨之增加后逐漸穩(wěn)定,這是由于煙具3＃每抽吸20 口氣溶膠ACM較大,隨著抽吸口數(shù)的增加,單張濾片對氣溶膠中粒相物的捕集能力趨于飽和。以抽吸20口為一個單位,抽吸5個單位所得測定值的RSD 均小于10%,說明每20口的氣溶膠的釋放穩(wěn)定性較好。電子煙中TSNAs含量非常低,為了保證痕量的TSNAs能夠被檢出,必須捕集足夠多的氣溶膠,因此在實際樣品測定中可以20口氣溶膠為一個單位進行濾片捕集,收集2張濾片,以其檢測結(jié)果的平均值作為測定值。

2.4 電子煙功率的選擇

功率是市售電子煙的一個重要規(guī)格參數(shù),與電子煙霧化效果關(guān)系密切,試驗選用可調(diào)功率電子煙考察了不同功率(10,20,40,80,120,170,225 W)下電子煙抽吸產(chǎn)生的氣溶膠ACM 及4種TSNAs含量的變化趨勢,結(jié)果表明:電子煙氣溶膠ACM 及4種TSNAs釋放量隨著電子煙功率的增加而增加并逐漸趨于穩(wěn)定,因此在本試驗中,對于可變功率電子煙均在其最大功率下進行抽吸,對于不可變功率電子煙就在產(chǎn)品設(shè)定功率下進行抽吸。

2.5 色譜行為

按照優(yōu)化的試驗條件分析電子煙煙液及氣溶膠,所得色譜圖見圖3。

圖3 電子煙煙液及氣溶膠中TSNAs的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of TSNAs in e-cigarette liquid and aerosol

2.6 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以4種TSNAs的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標物的峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線,其線性參數(shù)見表3。

以3倍、10倍信噪比(S/N)分別計算目標物的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

由表3可知,4種TSNAs的檢出限為0.002～0.015 ng·g－1(煙液)和0.001～0.008 ng/20口(氣溶膠);測定下限為0.007～0.052 ng·g－1(煙液)和0.004～0.026 ng/20口(氣溶膠),低于相關(guān)文獻報道[6-7,12,17],滿足電子煙煙液及氣溶膠樣品中痕量TSNAs的測定需求。

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法分析電子煙煙液和氣溶膠,以一天之內(nèi)連續(xù)5次測定值的相對標準偏差(RSD)考查日內(nèi)精密度,以連續(xù)5天的測定值RSD 考查日間精密度,結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of test for precision(n＝5)

由表4 可知,電子煙煙液樣品日內(nèi)RSD 為0.78%～1.5%,日間RSD 為1.3%～2.1%;電子煙氣溶膠樣品日內(nèi)RSD 為0.96%～2.5%,日間RSD為4.9%～6.3%,說明方法具有很好的重復(fù)性。

按照試驗方法對電子煙煙液及氣溶膠進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,并計算回收率,結(jié)果見表5。

表5 回收試驗結(jié)果Tab.5 Results of test for recovery

由表5 可知,電子煙煙液樣品中4 種TSNAs的回收率為90.7%～103%,氣溶膠樣品中的回收率為92.0%～108%,滿足電子煙TSNAs含量的檢測要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法分析市售不同品牌電子煙樣品1＃～14＃,其中1?！?0＃為可添加煙液的電子煙,11＃～14＃為自帶煙液的一次性電子煙(所用煙液無法取出測試),并計算煙液和氣溶膠中4種TSNAs的含量和總量,結(jié)果見表6。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 Analytical results of samples

由表6可知,傳統(tǒng)卷煙較電子煙中TSNAs含量高了近百倍[14],電子煙中NNN 及NAT 的檢出量相對較高,質(zhì)量分數(shù)分別在40.57 ng·g－1以內(nèi)、31.94 ng·g－1以內(nèi)(煙液)及6.40 ng/20 口以內(nèi)、5.03 ng/20口以內(nèi)(氣溶膠);NAB的檢出數(shù)量及含量均較低,質(zhì)量分數(shù)分別為8.33 ng·g－1以內(nèi)(煙液)和1.28 ng/20口以內(nèi)(氣溶膠);另一種強致癌物NNK 的質(zhì)量分數(shù)分別為11.22 ng·g－1以內(nèi)(煙液)、1.89 ng/20 口(氣溶膠)。其中樣品6＃與9＃TSNAs含量遠高于其他樣品,推測可能與其煙液配方有關(guān),比如可能添加了TSNAs含量較高的煙草提取物。此外,電子煙氣溶膠中TSNAs與對應(yīng)煙液成分密切相關(guān),電子煙抽吸之后產(chǎn)生的氣溶膠中TSNAs含量與所用煙液中的TSNAs含量呈正相關(guān),TSNAs含量較高的煙液抽吸之后產(chǎn)生的氣溶膠中TSNAs含量也較高,如樣品6＃和樣品9＃;未檢出TSNAs的煙液抽吸之后產(chǎn)生的氣溶膠中TSNAs同樣未檢出,如樣品1＃和樣品2＃。

本工作建立了HPLC-MS/MS測定電子煙煙液及氣溶膠中4種TSNAs含量的方法,該方法的檢出限低、靈敏度高、重復(fù)性好、準確度高,可以滿足電子煙煙液及氣溶膠中痕量TSNAs的快速準確測定,可為今后電子煙的研發(fā)、質(zhì)量安全監(jiān)管、參數(shù)設(shè)置以及濾片捕集方式選擇等提供重要的技術(shù)參考。