盧端萍,陳 碩,程佳華,謝宋陽,王 勇

(福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院,福州 350001)

為了使化妝品在生產(chǎn)、使用和保存過程中免受微生物污染,保證化妝品的有效性,生產(chǎn)過程中往往需要加入防腐劑,甲基異噻唑啉酮(MI)和卡松由于水溶性較好,常用于洗發(fā)水、沐浴露、潔面乳等淋洗類化妝品中?？ㄋ墒羌谆犬愢邕蜻?MCI)、MI與氯化鎂及硝酸鎂的混合物(MCI和MI質(zhì)量比為3∶1)。MI和MCI具有較強(qiáng)的致敏性,長期使用含高添加量的MI和MCI的化妝品會引起接觸性皮炎[1-4]。歐盟(EU)2017/1224 公告對化妝品法規(guī)EC 1223/2009附錄V 進(jìn)行修訂,規(guī)定MI僅可用于淋洗類化妝品,使用限量由0.01%降至0.001 5%。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版[5]中規(guī)定:化妝品中不能單獨使用MCI,MI最大允許添加量為0.01%;卡松僅能用于淋洗類化妝品,且不能和MI同時使用,最大允許添加量為0.001 5%。因此,有必要對化妝品中MI或卡松的含量進(jìn)行監(jiān)控。相關(guān)文獻(xiàn)中的MI和MCI測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6-11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12-16]、氣相色譜法(GC)[17-18]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的MI及MCI的測定方法為HPLC,兩種成分的測定下限均為0.001 3%(即13μg·g-1),與卡松的最大允許添加量0.001 5%(即15μg·g－1)接近,說明該方法的靈敏度較低,同時,MI和MCI的出峰時間較早,容易被樣品中極性較大的雜質(zhì)干擾,無法被準(zhǔn)確地測定。淋洗類化妝品中含有大量的表面活性劑,成分較為復(fù)雜,且卡松的添加量較低,因此需要建立一個高效、靈敏、準(zhǔn)確的測定方法。本工作根據(jù)淋洗類化妝品的特性,對前處理、色譜條件、基質(zhì)效應(yīng)等進(jìn)行考察,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測定90批淋洗類化妝品中MI和MCI含量的方法,以期為化妝品中MI和MCI含量的準(zhǔn)確測定提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜儀,配XEVO TQ-S型三重四極桿質(zhì)譜儀;XP 205型電子天平。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:稱取適量MI、MCI,加甲醇溶解并稀釋配制成40 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別移取適量MI、MCI單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1,2 mL于100 mL容量瓶中,用10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋配制成400,800μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用10%甲醇溶液逐級稀釋配制成含0.8,2,4,8,20,40,80,120,160,200μg·L－1MI和1.6,4,8,16,40,80,160,240,320,400μg·L－1MCI的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

MI純度為98.6%;MCI純度為99.9%;甲醇為色譜純,其余試劑為分析純;試驗用水為一級水。

試驗樣品為近兩年福建省監(jiān)督抽檢樣品,共90批,其中沐浴類產(chǎn)品48批(含嬰童類產(chǎn)品13批和沐浴洗發(fā)類產(chǎn)品1批)、洗發(fā)類產(chǎn)品33批(含嬰童類產(chǎn)品4批)、潔面類產(chǎn)品9批。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),柱 溫25 ℃;流量0.3 mL·min－1;進(jìn)樣量1μL;流動相A 為甲醇,B為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液;按表1程序進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式(ESI＋);毛細(xì)管電壓0.5 kV;脫溶劑溫度500 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L·h－1,錐孔反吹氣流量150 L·h－1;霧化器壓力0.7 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分析時間從第4.5 min開始,持續(xù)到第15 min;其他質(zhì)譜參數(shù)見表2,其中,“*”為定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

將0.2 g 樣品置于25 mL 納氏比色管中,加10%甲醇溶液1 mL,渦旋30 s。加入10%甲醇溶液7 mL,超聲提取10 min,依次加入100 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液0.2 mL 和200 g·L－1乙酸鋅溶液0.2 mL,并分別混勻,用10% 甲醇溶液定容至10 mL,搖勻,靜置5 min,取上清液過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗方法分析含MI和MCI分別為40,80μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和3種不同類型的實際樣品,所得總離子流色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和3種類型樣品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard solution and 3 types of samples

2.2 色譜柱的選擇

試驗考察了 Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters UPLC BEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters CORTES T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Agilent SB Aq色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)、Agilent Poroshell HPH-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中MI和MCI的分離效果。結(jié)果顯示:Waters UPLC BEH HILIC 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)所得MI和MCI出峰時間過早;Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、Waters CORTES T3 色 譜柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm)所得MI出峰時間較早,MCI響應(yīng)值較低;Agilent SB Aq色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell HPH-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)所得MI及MCI的色譜峰峰形均較差,且MCI 在Agilent Poroshell HPH-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.7μm)上出峰時間延遲較多;Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)所得MI和MCI的出峰時間適當(dāng)、色譜峰峰形較好、響應(yīng)值較高,且該色譜柱耐水性好,故試驗選擇的色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)。

2.3 流動相的選擇

試驗分別以甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液、含0.2%甲酸的甲醇溶液-0.1%甲酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫,考察了不同流動相對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中MI和MCI分離效果的影響。結(jié)果顯示:用以上流動相進(jìn)行梯度洗脫時,MI、MCI的峰形均較好,響應(yīng)值均較高且相差不大?？紤]到操作的簡便性,試驗選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相。

2.4 樣品前處理條件的選擇

試驗曾嘗試先用飽和氯化鈉溶液分散樣品,再用乙腈萃取3 次,但在飽和氯化鈉溶液中檢出了MI,這是由于MI極性較大,無法完全轉(zhuǎn)移至乙腈層中,導(dǎo)致MI提取不完全。試驗又按照試驗方法提取樣品,并考察了不同體積分?jǐn)?shù)(10%,30%,50%,100%)甲醇溶液作提取劑及不同超聲提取時間(5,10,15,20 min)對樣品中MI和MCI提取效果的影響。結(jié)果顯示:不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液的提取效果無明顯差別,且當(dāng)超聲提取時間為10 min時,樣品中MI和MCI已被提取完全。從MI與MCI極性較大以及應(yīng)減少有機(jī)溶劑使用的角度考慮,試驗選擇以10%甲醇溶液提取樣品,超聲提取時間為10 min。

2.5 沉淀劑用量的選擇

試驗以100 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液和200 g·L－1乙酸鋅溶液作為沉淀劑沉淀樣品中的蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì),并分別考察這2種沉淀劑用量分別為0.1,0.2 mL時的沉淀效果。結(jié)果顯示:沉淀劑的用量各為0.2 mL 時,離心后所得的沉淀較多,但MI、MCI的含量與0.1 mL時的一致?？紤]到沉淀過程應(yīng)盡可能除去較多雜質(zhì),試驗選擇2種沉淀劑的用量均為0.2 mL。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)影響的消除

淋洗類化妝品中的基質(zhì)比較復(fù)雜,表面活性劑等水溶性雜質(zhì)容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)對質(zhì)譜檢測影響較大。考慮到MI、MCI的極性較大,在反相色譜柱上不易保留,為了延長MI、MCI的保留時間,應(yīng)適當(dāng)提高水相的比例,試驗在梯度洗脫程序中,設(shè)置了先用0.1%甲酸溶液洗脫4.5 min這一步驟,以去除表面活性劑等水溶性雜質(zhì),且該時間段不進(jìn)行質(zhì)譜分析,從而降低基質(zhì)效應(yīng)。試驗還對比了HLB固相萃取柱凈化前后的基質(zhì)效應(yīng),按照試驗方法分析實際樣品,并將得到的上清液過不同規(guī)格(60,100,200 mg)HLB固相萃取柱,結(jié)果顯示:MI在60,100 mg 的HLB 固相萃取柱上較容易被洗脫,在200 mg 的HLB 固相萃取柱上保留效果較好,但過柱所得的洗脫液中MI、MCI的含量與不過柱的上清液中的一致,說明是否過柱帶來的基質(zhì)干擾對測定的影響較小,試驗選擇不凈化直接測定。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以2種化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表3。

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.8 重復(fù)性試驗

按照試驗方法平行測定一批沐浴類產(chǎn)品6次,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),MI和MCI的測定值分別為1.91,3.23μg·g－1,RSD 分別為0.70%,2.1%,表明該法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

將按照試驗方法處理得到的樣品溶液在室溫下放置0,2,4,8,12,16,20,24 h后進(jìn)樣,計算得MI、MCI峰面積的RSD 分別為2.1%,3.2%,說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收試驗

按照試驗方法對空白沐浴露樣品進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定3次,計算回收率,結(jié)果見表4。

表4 回收試驗結(jié)果Tab.4 Results of test for recovery

由表4 可知:MI、MCI 的回收率分別為94.3%～107%和93.4%～106%,說明本方法的回收率較好。

2.11 樣品分析

按照試驗方法分析90批淋洗類化妝品,并與標(biāo)簽標(biāo)識符合情況進(jìn)行比對,同時用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的HPLC 測定了抽檢的15 批產(chǎn)品中的MI、MCI含量,并同本方法進(jìn)行比對,結(jié)果見表5。其中編號為61的樣品MI色譜峰附近有干擾峰,無法被準(zhǔn)確測定。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of samples

表5(續(xù))

表5(續(xù))

由表5可知,針對沐浴類產(chǎn)品:MI在成人、嬰童類產(chǎn)品中的檢出數(shù)量分別為28,10個,其含量超過歐盟化妝品法規(guī)EC 1223/2009 規(guī)定的限值(0.001 5%)的產(chǎn)品分別為4,3個,除1個嬰童類產(chǎn)品中MI的檢出量為98.2μg·g－1,接近我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的限值(0.01%)外,其他產(chǎn)品中MI含量均未超過限值;MCI在成人、嬰童產(chǎn)品中的檢出數(shù)量分別為17,7 個,最大檢出量分別為15.7,9.53μg·g－1。針對洗發(fā)類產(chǎn)品:MI在成人、嬰童類產(chǎn)品中的檢出數(shù)量分別為25,2個,其含量超過歐盟化妝品法規(guī)EC 1223/2009 規(guī)定的限值(0.001 5%)的產(chǎn)品分別為3,1 個,但均未超過《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的限值;MCI在成人、嬰童類產(chǎn)品中的檢出數(shù)量分別為21,1個,最大檢出量分別為15.2,0.16μg·g－1。針對潔面類產(chǎn)品:MI的檢出數(shù)量為3個,最大檢出量為2.67μg·g－1,未超過歐盟化妝品法規(guī)EC 1223/2009 及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的限值;MCI的檢出數(shù)量為2個,最大檢出量為3.64μg·g－1。共有48批產(chǎn)品同時檢出MCI和MI,從二者的含量比的分布來看:33批產(chǎn)品MCI含量較MI的高,二者含量比為1.2∶1～3.7∶1,比值約為3∶1(2.6∶1～3.4∶1,依據(jù)GB/T 29666－2013《化妝品用防腐劑 甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮與氯化鎂及硝酸鎂的混合物》確定)的產(chǎn)品僅9批,符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》卡松中MCI與MI質(zhì)量比為3∶1的要求且未超過規(guī)定的限值(0.001 5%);15批產(chǎn)品中MI含量較MCI的高,MCI和MI的含量比為1∶1.1～1∶383,其中有8批產(chǎn)品MI含量比MCI高5倍以上,懷疑這些產(chǎn)品同時添加了卡松與MI。從與標(biāo)簽標(biāo)識符合情況來看,有25批(約28%)產(chǎn)品檢出情況與標(biāo)簽標(biāo)識的不一致:37批產(chǎn)品標(biāo)簽同時標(biāo)識了MI及MCI,但有3批產(chǎn)品未檢出MCI;14批產(chǎn)品標(biāo)簽只標(biāo)識了MI,但其中有5批產(chǎn)品還檢出了MCI;39批產(chǎn)品標(biāo)簽未標(biāo)識MI及MCI,但有9批產(chǎn)品同時檢出了MI及MCI,8批產(chǎn)品檢出了MI;涉及的產(chǎn)品包括沐浴類產(chǎn)品15批,洗發(fā)類產(chǎn)品10批。從方法比對結(jié)果來看:2種方法的測定值基本一致,但規(guī)范方法大多數(shù)測定值小于其測定下限(13.00μg·g－1)。

本工作建立了UHPLC-MS/MS測定淋洗類化妝品中MI和MCI的方法,并對實際樣品中MI及卡松的可能添加及與標(biāo)簽標(biāo)識符合情況進(jìn)行分析。該方法準(zhǔn)確度較高、專屬性較好、檢出限較低,可用于淋洗類化妝品中MI和MCI含量的測定。