李 莉,李 碩,王海燕,孫 磊

(中國食品藥品檢定研究院,北京 100050)

熊果苷能夠抑制酪氨酸酶[1-3],阻止黑色素形成,是祛斑美白類化妝品中使用頻次較高的功效原料[1]。按照結(jié)構(gòu)不同,可將熊果苷分為α-熊果苷和β-熊果苷,兩者為差向異構(gòu)體[4-5]。氫醌和苯酚具有美白作用,但同時(shí)還具有皮膚刺激性和致敏性,長期使用會損傷心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng),甚至有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[2,5],已經(jīng)被我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》列為禁用物質(zhì)[6]。在一定環(huán)境條件下,熊果苷可被分解形成氫醌[7-11],基于安全考慮,歐盟消費(fèi)者安全科學(xué)委員會(SCCS)建議β-熊果苷在面霜中最高添加量為7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),以下殘留量、添加量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)),氫醌最高殘留量為0.000 1%[10];α-熊果苷在面霜中最高添加量為2%,潤膚露中最高添加量為0.5%[11]。目前我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中對熊果苷的種類規(guī)格、使用限量、理化檢測方法、功效評價(jià)方法等均未進(jìn)行規(guī)定,導(dǎo)致無法對該類產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行科學(xué)評估。

祛斑美白類化妝品在我國需求量大,消費(fèi)者和媒體的關(guān)注度高,但相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊,管理及使用均不規(guī)范。為了更好地對這類產(chǎn)品進(jìn)行安全性評價(jià),有必要建立化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚同時(shí)測定的方法,為祛斑美白類化妝品的標(biāo)準(zhǔn)制定和風(fēng)險(xiǎn)評估提供技術(shù)支持。

熊果苷的測定方法主要為高效液相色譜法[12-16]和毛細(xì)管電泳法[17]。氫醌和苯酚的測定方法主要為高效液相色譜法[16,18]、氣相色譜法[19]和氣相色譜-質(zhì)譜法[8,20]等。同時(shí)測定化妝品中熊果苷、氫醌和/或苯酚的方法多為高效液相色譜法[21-23],而相關(guān)文獻(xiàn)中涉及的熊果苷均為β-熊果苷。目前能夠分離并測定祛斑美白類化妝品中α-熊果苷和β-熊果苷這兩種差向異構(gòu)體并同時(shí)檢測氫醌和苯酚的檢測方法尚不多見,已有報(bào)道的分析方法[16,21]也存在α-熊果苷和β-熊果苷達(dá)不到基線分離的問題。鑒于此,本工作選擇了對異構(gòu)體有較強(qiáng)分離能力的ADME色譜柱作為分析柱,建立了同時(shí)測定化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚含量的高效液相色譜法,并將該方法應(yīng)用到102批祛斑美白類化妝品的檢測工作中,以期為該類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚的風(fēng)險(xiǎn)評估提供進(jìn)一步的科學(xué)指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;AL204 型電子天平;SI Vortex Genie 2型渦旋混勻器;KQ 3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器;Advance RO＋Pro VF型超純水純化系統(tǒng)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別稱取α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚對照品各10 mg(精確到0.000 1 g),用甲醇溶解并稀釋配制成1 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL、β-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL、氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2 mL和苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2 mL,置于同一個(gè)10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋配制成α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚質(zhì)量濃度分別為100,100,20.0,20.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。其他所需質(zhì)量濃度均由此溶液用甲醇逐級稀釋制得。

α-熊果苷對照品的純度為98.0%;β-熊果苷對照品的純度為99.0%;氫醌對照品的純度為99.4%;苯酚對照品的純度為99.9%;甲醇為色譜純。

試驗(yàn)所用祛斑美白類化妝品樣品采自批發(fā)市場、商場、超市、網(wǎng)店,產(chǎn)品外包裝標(biāo)稱具有祛斑、淡斑、美白、嫩白、透白等功效。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫25 ℃;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量為10μL。檢測波長:α-熊果苷、β-熊果苷、苯酚均為283 nm,氫醌為290 nm。流動相A 為水,B為甲醇;梯度洗脫程序:0～5.0 min時(shí),A 為96%;5.0～15.0 min 時(shí),A 由96% 降 至10%,保 持5.0 min;20.0～20.1 min 時(shí),A 由10%跳轉(zhuǎn)至96%,保持5.0 min。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取祛斑美白類化妝品1.0 g(精確到0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,振蕩30 s后密塞,超聲提取10 min。冷卻至室溫后,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液過0.45μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

α-熊果苷和β-熊果苷的最大吸收波長為283 nm,氫醌的最大吸收波長為290 nm,苯酚的最大吸收波長為271 nm。綜合考慮4種物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度,試驗(yàn)選擇283 nm 作為α-熊果苷、β-熊果苷和苯酚的檢測波長,290 nm 作為氫醌的檢測波長。

2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了X-Bridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等4種色譜柱對加標(biāo)樣品(α-熊果苷和β-熊果苷加標(biāo)量為100 mg·kg－1,氫醌和苯酚的加標(biāo)量為20 mg·kg－1)中4種目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明:X-Bridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)和CAPCELL PAK PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)均不能實(shí)現(xiàn)α-熊果苷和β-熊果苷的基線分離(分離度小于1.5),而使用CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分析時(shí),4種目標(biāo)物均能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離,且色譜柱特異性良好,雜質(zhì)對目標(biāo)物無干擾。因此,試驗(yàn)選擇的色譜柱為CAPCELL PAK ADME色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

2.3 提取條件的選擇

α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚均易溶于甲醇,因此選擇甲醇作為提取溶劑。為了充分提取樣品中的目標(biāo)物,試驗(yàn)考察了超聲提取時(shí)間分別為5,10,15,20,25 min 時(shí)對面霜(膏霜劑型)和精華水(水劑乳液劑型)兩種化妝品基質(zhì)中4種目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果表明:超聲提取10 min時(shí),4種目標(biāo)物的提取效果較好;繼續(xù)延長超聲提取時(shí)間,β-熊果苷含量呈下降趨勢,推測原因?yàn)殚L時(shí)間超聲提取產(chǎn)生的熱量造成了熊果苷的分解[16]。因此,試驗(yàn)選擇超聲提取時(shí)間為10 min。

按照試驗(yàn)方法分析α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚4種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)稱含有熊果苷成分的化妝品樣品溶液,所得色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按儀器工作條件分析α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:α-熊果苷和β-熊果苷的質(zhì)量濃度均在1.0～50.0 mg·L－1內(nèi)、氫醌在0.5～10.0 mg·L－1內(nèi)、苯酚在0.2～10.0 mg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見表1。

分別以3 倍的信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),以10倍的信噪比計(jì)算測定下限(10S/N),α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限和測定下限見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法分別對面霜(膏霜劑型)和精華水(水劑乳液劑型)空白樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知,回收率為92.0%～112%,RSD 為0.90%～5.8%。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對102批市售祛斑美白類化妝品樣品進(jìn)行檢測,2批樣品檢出禁用組分氫醌,占總樣品數(shù)量的2%,其檢出量分別為52.8,43.0 mg·kg－1;在22批樣品中檢出α-熊果苷或β-熊果苷,其中β-熊果苷檢出量為0.01%～4.0%,均未超過SCCS規(guī)定的最高添加量(7%);α-熊果苷檢出量為0.01%～4.8%,其中有2批國產(chǎn)面霜中的α-熊果苷檢出量超過SCCS規(guī)定的最高添加量(2%)。此外,試驗(yàn)結(jié)果表明有19批樣品存在標(biāo)簽標(biāo)識與檢出物質(zhì)不符的問題,如標(biāo)簽標(biāo)識含熊果苷但并未檢出(15批),或者標(biāo)簽未標(biāo)識熊果苷但檢出了熊果苷(4批)?；瘖y品標(biāo)簽標(biāo)識作為消費(fèi)者購買化妝品時(shí)重要的參考依據(jù),直接影響消費(fèi)者對于商品的知情權(quán),如果未按照要求標(biāo)注成分表內(nèi)容或者標(biāo)注的內(nèi)容與實(shí)際成分不符,有可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)或誤用的風(fēng)險(xiǎn)。建議有關(guān)部門進(jìn)一步規(guī)范熊果苷作為美白成分添加到化妝品產(chǎn)品中的標(biāo)簽標(biāo)識要求,并加大對化妝品中添加禁用物質(zhì)的打擊力度,切實(shí)保障消費(fèi)者的用妝安全。

本工作建立了同時(shí)測定祛斑美白類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚含量的高效液相色譜法,該方法簡便快捷、準(zhǔn)確度高,適用于大批量樣品快速測定,可為熊果苷等美白原料使用限量研究、安全評估等工作提供檢測依據(jù)和技術(shù)支持。