李勇，鄧卓丹，許均華

郴州市食品藥品檢驗檢測中心（郴州 423000）

果膠是一種雜多糖，廣泛分布在高等植物的細胞壁和細胞內層[1]。果膠多糖是除了纖維素外最豐富的植物多糖，作為蔬菜和水果的天然成分，是一種極其安全的多功能食品添加劑，同時具有抗腫瘤、抗氧化、預防慢性疾病、調節(jié)免疫等生物活性，已被廣泛應用于食品和制藥等行業(yè)。

鱷梨（Persea americanaMill）是月桂科植物的雙子葉水果，生長于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)。近年來，鱷梨全球產量從2000年到2018年增長了2.3倍，2019年達到641萬 t[2]。而鱷梨工業(yè)化只用鱷梨果肉生產油脂、調味料等，從中產生的果皮和種子[3]約占整個水果質量的25%，而果皮占11%~17%[4-5]。據(jù)報道，鱷梨果皮具有高含量生物活性化合物，例如縮水單寧、酚酸和黃酮醇羥基苯甲酸等[3-4,6-7]，其被用作抗氧化劑、抗癌劑、抗菌劑等。但是，從鱷梨皮中提取果膠的有關研究及其相關性質卻鮮有報道。

超聲波提取是新興綠色技術，其已被廣泛應用于不同植物中提取果膠，如葡萄柚皮[8]、酸橙皮[9]、茄子皮[10]。超聲輔助提取可以提高果膠的收率并顯著減少提取時間和殘留產物，提高加熱速率，節(jié)約能源并降低成本[11]。

以超聲波輔助酸提取鱷梨皮果膠，采用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化浸提工藝，并對其氧化特性進行研究，以期為鱷梨的深度開發(fā)及優(yōu)質果膠新資源的生產利用提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱷梨，市售；D-半乳糖醛酸、DPPH、牛血清蛋白，HPLC級，上海源葉生物科技有限公司；咔唑、NaOH、磷酸、考馬斯亮藍、無水乙醇、無水甲醇、水楊酸、甲硫氨酸，均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（AR124CN），上海奧豪斯儀器有限公司；pH計（FE20型），上海梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗器（SK5200HP），上?？茖С晝x器有限公司；紫外可見分光光度計（TU1810型），北京普析通用儀器有限責任公司；ULTRA TURRAX（T25 digital），德國IKA儀器設備有限公司；離心機（H1850R），湖南湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9123A），上海森信實驗儀器有限公司；冷凍干燥機（Christ Alpha1型），德國Marin Christ公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果膠提取

將鱷梨果皮洗凈成碎片，在95 ℃下熱燙5 min以鈍化酶活，再放入55 ℃烘箱干燥至恒重。將干燥的果皮以粉碎機粉碎后于180 μm篩過濾，粉末以1∶30（g/mL）的比例溶解于蒸餾水，用鹽酸調節(jié)至pH為2，在超聲頻率320 W，溫度70 ℃條件下加熱30 min，將所得溶液冷卻至室溫，在4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，得到的濾液用無水乙醇三倍體積沉淀后靜置1 h，為了減少果膠中含有的色素、可溶性糖和脂質等雜質，用95%乙醇將凝結的果膠洗滌3次，用尼龍布過濾果膠分散體，凍干24 h。

1.3.2 單因素試驗設計

在1.3.1的試驗條件下，以超聲功率（160，200，240，280，320和360 W）、超聲溫度（40，50，60，70，80和90 ℃）、超聲時間（10，20，30，40，50和60 min）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）、pH（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5）為影響因素，以鱷梨皮果膠得率為評價指標，對超聲波輔助酸提取鱷梨皮果膠工藝進行優(yōu)化。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用響應面（Box-Behnken）設計（表1），對影響顯著的因素進行優(yōu)化，進行二次多項式回歸擬合，建立自變量數(shù)學模型，結合方差分析、各因素水平及其交互作用對結果進行評價，并繪制相應的響應曲面圖，確定鱷梨皮果膠得率的最佳提取條件。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平

1.3.4 半乳糖醛酸測定

采用咔唑比色法測定半乳糖醛酸含量。準確移取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL質量濃度為1.0 g/L的半乳糖醛酸標準貯備溶液于6個50 mL容量瓶中，用水稀釋定容后搖勻，得到質量濃度為0，20，40，60，80和100 mg/L的標準溶液。分別移取1.0 mL不同濃度的標準溶液于6支試管中，冷水循環(huán)下加入6.0 mL濃硫酸，再放置85 ℃水浴鍋中加熱25 min，冷至室溫，加入0.50 mL 0.15%的咔唑無水乙醇溶液，搖勻，在暗處放置30 min，以試劑空白為參比，在530 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線，標準曲線方程為Y=0.006 1X+0.007 8，R2=0.999 1。樣品稀釋液代替半乳糖醛酸標準液重復上述步驟測定吸光度。果膠半乳糖含量Y按式（1）計算。

式中：C為半乳糖醛酸的質量濃度，mg/mL；V為果膠提取液的總體積，mL；N為提取液的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質量，g。

1.3.5 蛋白質和酯化度測定

果膠中的總蛋白質含量通過Bradford蛋白質測定試劑盒測定[12]，其標準曲線方程為Y=3.157X-0.008 4，R2=0.999 5。采用滴定法[13]對果膠的酯化度進行分析。將0.5 g果膠溶解于250 mL去離子水，加入2 mL乙醇，混合后用磁力攪拌，以3滴1%酚酞作指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定并記錄滴定的體積V1，加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，靜置15 min使果膠去酯化。向溶液中加入20 mL HCl（0.5 mol/L）和3滴酚酞試劑，用0.1 mol/L NaOH再次操作，消耗的體積記為V2。至溶液呈粉紅色且30 s內不褪色。酯化度按式（2）計算。

1.3.6 鱷梨皮果膠的抗氧化特性

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

測得無水甲醇溶液在吸光度A517處達到1.2~1.3。稱取0.002 g DPPH粉末于25 mL無水甲醇中充分溶解，以甲醇溶液與樣品溶液4∶1（mL/g）的比例加入具塞試管中，將混合溶液用振蕩器振蕩后，在30 ℃水浴鍋中恒溫避光加熱45 min，以甲醇為對照組，VC作為標準對照，在吸收波長為517 nm處測得樣品DPPH的自由基清除率，按式（3）計算[14]。

式中：A0為對照組甲醇的吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.3.6.2 ABTS體外抗氧化活性

將ABTS以7.0 mmol/L的濃度溶于水中，與2.45 mmoL/L過硫酸鉀等體積反應，生成ABTS自由基陽離子（ABTS+·），在室溫（25±2 ℃）下暗靜置12~16 h。分析之前，ABTS+·使用0.22 μm濾膜過濾，用10 mmoL/L（pH 7.4）磷酸緩沖溶液稀釋，在紫外可見分光光度計734 nm處的吸光度達0.700（±0.02）。取0.1 mL不同質量濃度樣品溶液，加入到3.9 mL已稀釋的ABTS+·溶液中，充分混合6 min后在波長734 nm處讀取吸光度（A1）。另外，把0.1 mL甲醇溶液加入3.9 mL ABTS+·溶液，混合后測得吸光度（A0）；把1.0 mL樣品溶液加入到3.9 mL磷酸緩沖溶液中混勻，測其吸光度（Aj）。以VC作為標準對照，ABTS自由基清除率按式（4）計算。

1.3.6.3 羥自由基（·OH）清除率

參照趙俊仁等[15]的方法。將2.00 mL 1.80 mmol/L FeSO4溶液、1.50 mL 1.80 mmol/L水楊酸-乙醇溶液加入到1.00 mL不同質量濃度的樣品溶液中，混合0.10 mL 0.03%的H2O2溶液以啟動反應，充分搖勻，在37℃下靜置30 min。以蒸餾水作對照組，在510 nm波長處測定吸光度。以VC作為標準對照，羥自由基清除率按式（5）計算。

1.3.6.4 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率

分別將0.40 mL 0.13 mol/L甲硫氨酸、0.02 mmol/L維生素B2、0.70 mmol/L NBT溶液加入到0.40 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）中，振蕩搖勻后分別加入0.40 mL不同質量濃度的樣品溶液和1.00 mL蒸餾水，充分混合。將混合液置于35 ℃光照環(huán)境反應20 min，在560 nm波長處測定樣品吸光度。以未添加甲硫氨酸和樣品溶液的作為空白組，未添加樣品的為對照組。以VC作為標準對照，樣品超氧陰離子自由基清除率按式（6）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗平行3次，結果表示為平均值±標準差。用SPSS Statistics，Origin 2018和Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間對果膠得率的影響

如圖1（A）所示：隨著提取時間從10 min增加到30 min，得率顯著上升，果膠得率從（14.71±0.1）%增加到（15.9±0.11）%；之后得率呈下降趨勢，可能由于超聲提取時間過長導致了果膠發(fā)生了結構分解。當超聲時間為30 min時，果膠的提取效果最佳。

圖1 不同單因素條件對鱷梨皮果膠得率的影響

2.1.2 料液比對果膠得率的影響

如圖1（B）所示：隨著料液比從1∶15（g/mL）至1∶30（g/mL），較高的料液比會使更多的溶劑進入粉末中，從而使更多果膠溶出至溶劑中，果膠得率從（13.94±0.21）%增加到（15.45±0.13）%；當料液比大于1∶30（g/mL）時，果膠得率逐漸下降，可能是由于萃取劑過量導致傳質速率降低。因此，選用料液比1∶30（g/mL）時得率最高。

2.1.3 超聲功率對果膠得率的影響

如圖1（C）所示：當超聲功率從160 W增加到320 W時，果膠得率呈現(xiàn)上升趨勢，當功率達到320 W時，得率達到最大，隨后急劇下降。由于功率增大時，其對植物細胞破碎作用加大，破壞了原有結構，從而使果膠得率降低。故適宜超聲功率選擇320 W。

2.1.4 超聲溫度對果膠得率的影響

如圖1（D）所示，隨著超聲溫度的升高，果膠得率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，在90 ℃時得率達到最大，可能是溫度的升高有利于果膠與溶劑充分混合后溶出，從而增加果膠得率。

2.1.5 pH對果膠得率的影響

如圖1（E）所示：當pH從1.0增加到1.5時，果膠得率稍有上升趨勢，隨后急劇下降，可能是當酸度過弱時，更多的原果膠不易轉化為水溶性的果膠；當酸度過強時，水溶性果膠在強酸條件下進一步脫脂裂解，使得果膠得率下降[16]。

2.2 響應面優(yōu)化結果

2.2.1 Box-Behnken優(yōu)化設計試驗結果

結合單因素試驗結果，固定超聲溫度90 ℃、溶液pH 1.5，以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）為考察因素，果膠得率Y為響應值，進行響應面試驗設計與分析，結果見表2。用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合，對應的二次回歸方程為Y=16.96+0.075A+0.32B+0.15C+0.17AB+0.15AC-0.29BC-0.69A2-0.17B2-0.065C2。

表2 Box-Benhnken 試驗設計與結果

2.2.2 響應面二次模型的方差分析

方差分析結果見表3?；貧w模型p＜0.01，極其顯著，方差失擬項p=0.254 5＞0.05，不顯著，校正決定系數(shù)R2=0.839 1，說明此回歸方程模型擬合優(yōu)度較好，合理可靠。變異系數(shù)（C.V.）=1.95%，表明變異概率較低，因此模型可用于預測鱷梨皮果膠的最高得率。由表3可見，超聲時間（B）對果膠得率影響顯著，同時A2對得率影響非常顯著（p＜0.001），其他均無顯著影響。依據(jù)p值大小，各因素的主效應順序為B＞C＞A。

表3 響應面二次模型的方差分析

2.2.3 各因素的交互作用

由圖2可見，隨著各因素水平的升高或延長，果膠得率均呈現(xiàn)先增大后減少的變化特征，響應面有極大值。響應面陡峭度、等高線形狀與密集度可以反映出兩因素之間交互作用的程度[17]。圖2（B）中超聲功率與料液比之間等高線沿料液比軸變化密集，呈橢圓狀，坡度相對較陡，表明兩因素間存有較明顯的促進交互作用，且料液比對鱷梨皮果膠提取量的影響程度大于超聲功率。另外，在圖2（A）中，等高線呈圓形，表示料液比和超聲時間交互作用不明顯，兩因素間無促進作用。同理圖2（C）中等高線沿超聲時間軸變化密集，而超聲功率比軸變化相對稀疏，結合響應面陡峭程度也可以證明超聲時間的影響大于超聲功率。

圖2 各因素交互對鱷梨皮果膠提取率影響的響應面及等高線圖

2.2.4 驗證性試驗

通過Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)分析，最佳超聲波輔助酸法提取果膠的工藝條件為料液比1∶33.5（g/mL）、超聲時間40 min、超聲功率316.5 W，此條件下果膠得率預測值為（17±0.034）%。用試驗中得到的最佳提取工藝條件重復試驗。為便于實際操作，在料液比1∶33（g/mL）、超聲時間40 min、超聲功率317 W、超聲溫度90 ℃、pH 1.5條件下進行重復試驗以驗證最佳提取工藝條件，其平均得率為（16.9±0.18）%，與理論值較吻合，表明響應面優(yōu)化后的條件具有可行性。

2.3 果膠性質

最佳提取條件下提取的鱷梨皮果膠的化學成分示于表4中。果膠的半乳糖醛酸含量為（72±1.9）%，表明果膠較純。根據(jù)糧農組織，作為食品添加劑或藥物的果膠半乳糖醛酸含量不應低于65%[18]，表明此方法提取出的鱷梨皮果膠符合要求。鱷梨皮果膠的含量高于開心果綠皮果膠（66%）[14]和仙人掌榕果皮果膠（64.5%）[19]。另外，鱷梨皮果膠的酯化值為（63±2.1）%，歸類為高甲氧基果膠，高甲基酯化的果膠對內切PG和高溫似乎更穩(wěn)定[13]，具有很強的食品保藏潛力。所提果膠的蛋白質含量高于商業(yè)蘋果果膠（1.4%~1.6%）[20]，可能具有較好的乳化能力。

表4 鱷梨皮果膠的理化性質 單位：%

2.4 鱷梨皮果膠溶液的抗氧化活性

如圖3（A）所示，當果膠質量濃度從2 mg/mL增加到10 mg/mL時，鱷梨皮果膠DPPH自由基清除率從41.6%增加到76%，表明果膠的清除效果以濃度依賴性方式增加[21]。有研究曾報道，羥基的含量差異可能影響DPPH自由基的清除能力。Akihiro等[22]的研究也表明2-OaD-葡萄糖基-L-抗壞血酸（AA-2G）對DPPH自由基的清除活性低于抗壞血酸（AA），這是由于AA-2G的AA部分的C-2位的羥基被葡糖基取代，說明羥基與DPPH自由基的結合有利于DPPH自由基的清除。另外，DPPH自由基清除活性可能也與糖醛酸濃度相關[23]，而鱷梨皮果膠糖醛酸濃度較純，提高了自由基清除率。這表明DPPH自由基清除活性很大程度上是由于物質的化學組成差異所致。

如圖3（B）所示，在2~10 mg/mL濃度范圍內，鱷梨皮果膠溶液對ABTS自由基清除效果對濃度有很明顯的依賴性，在質量濃度為6 mg/mL時，清除率增長速率較大，并在10 mg/mL時達到最大，為72%。

如圖3（C）所示，OH·自由基的清除率隨著果膠溶液濃度的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，從濃度為2 mg/mL時的34.2%增加到濃度為10 mg/mL時的68.9%。

O2-·自由基作為主要的ROS，會產生次要的ROS，導致DNA、蛋白質和脂質的氧化損傷[24]。如圖3（D）所示，在2~6 mg/mL濃度范圍內，鱷梨皮果膠溶液的·自由基清除活性依賴劑量濃度的增加而增加。在6 mg/mL濃度下，溶液的O2-·自由基清除率達到最高，為69.3%。當果膠濃度大于6 mg/mL時，抗氧化活性沒有再明顯增加。

圖3 鱷梨皮果膠溶液的抗氧化活性

所有結果表明，鱷梨皮果膠溶液對DPPH自由基，ABTS自由基、OH·自由基、O2-·自由基有明顯的清除活性，說明此果膠的抗氧化能力較強。有報道稱，多糖的抗氧化活性與其給電子或給氫能力有關[25]?？赡苡捎邝{梨皮果膠溶液中有更多的親電基團，在酸性條件下可以加速O—H鍵中的氫釋放，從而提高了其抗氧化活性。

3 結論

利用三因素三水平Box-Behnken響應面設計，通過超聲波輔助酸優(yōu)化鱷梨皮果膠提取工藝條件，建立了高度相關的二次多項式數(shù)學優(yōu)化模型，并通過方差分析表明具有較好的擬合度。其最佳工藝為料液比1∶33（g/mL）、超聲時間40 min、超聲功率317 W、超聲溫度90 ℃、pH 1.5，以此獲得的得率為（16.9±0.18）%，果膠中的半乳糖醛酸、酯化度和蛋白質含量分別為（72±1.9）%，（63±2.1）%和（2.88±0.05）%?？寡趸Y果表明，在2~10 mg/mL濃度范圍內，鱷梨皮果膠溶液對DPPH自由基、ABTS自由基、OH·自由基、O2-·自由基的清除率分別達76%，72%，68.9%和69.3%，表明果膠抗氧化效果較好，可為后續(xù)鱷梨皮果膠的進一步研究和發(fā)展提供一定的理論依據(jù)，同時對提高鱷梨皮資源的綜合經濟效益具有重要意義。