劉曉亮 朱振安

在人工關(guān)節(jié)置換領(lǐng)域中，骨吸收活動(dòng)亢進(jìn)而造成的假體周圍骨溶解、骨缺損是關(guān)節(jié)置換手術(shù)面臨的重要挑戰(zhàn)之一[1, 2]。而破骨細(xì)胞是維持骨吸收作用的主要細(xì)胞，因此如何通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化從而調(diào)節(jié)骨量穩(wěn)定是當(dāng)前防治人工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解的研究重點(diǎn)。

紫云英苷(astragalin，C21H20O11，MW: 448.4g/mol)，是一種廣泛存在于植物中的類黃酮化合物。許多研究表明類黃酮化合物具有能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制骨關(guān)節(jié)內(nèi)的炎性反應(yīng)、抑制破骨細(xì)胞分化等生理作用[3, 4]。以往的研究中，紫云英苷在骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)中被驗(yàn)證具有抑制骨關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)成骨分化的功效[5～7]。然而紫云英苷對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響尚不得而知。因此，本研究通過(guò)使用核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB，RANKL)刺激C57BL/6小鼠的骨髓源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage, BMM)向破骨細(xì)胞分化，并以此為基礎(chǔ)研究了紫云英苷對(duì)小鼠BMM細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)試劑：CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Molecular Technology公司，細(xì)胞因子M-CSF、RANKL購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，TRAP染色試劑盒、鬼筆環(huán)肽、DAPI熒光染液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，紫云英苷(No.MB7087)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Real-time PCR 試劑盒與RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，TRAP、NFATc1、CTSK、GAPDH引物購(gòu)自生工生物(上海)股份有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4～6周齡雄性C57BL/6 小鼠，購(gòu)自上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可：SCXK(滬)2013-0016；使用許可：SYXK(滬)2018-0026]。無(wú)特定病原環(huán)境下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)規(guī)范遵循上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

3.細(xì)胞收集與培養(yǎng)：取4～6周齡的小鼠，處死后使用75%的乙醇溶液浸泡小鼠全身消毒20min。分離出小鼠的股骨與脛骨，使用細(xì)胞培養(yǎng)基反復(fù)沖洗股骨脛骨的髓腔。將沖洗得到的骨髓細(xì)胞與培養(yǎng)基混合液使用篩網(wǎng)過(guò)濾，離心后使用15ml含30ng/ml M-CSF的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于T75培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h后使用含30ng/ml M-CSF的培養(yǎng)基換液并棄去未貼壁的細(xì)胞與殘留的小鼠軟組織，即得原代BMM細(xì)胞。

4.CCK-8檢測(cè)：將BMM細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度種植于96孔板中，在孔中加入含不同濃度梯度的紫云英苷的培養(yǎng)基(0、12.5、25、50、100、200、400、800μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h之后，在每個(gè)孔內(nèi)換入含10μl CCK-8試劑的100μl培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，之后使用吸光度酶標(biāo)儀以650nm為參照，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定孔內(nèi)的吸光度(A)。

5.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase， TRAP)染色：將獲取的BMM細(xì)胞加入胰酶消化并重懸后，以8×103個(gè)/孔的濃度接種至96孔板中，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。配置含RANKL與不同濃度紫云英苷的培養(yǎng)基(0、50、100、200μmol/L)，培養(yǎng)5天后進(jìn)行鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)空白組細(xì)胞融合為多核巨細(xì)胞時(shí)使用TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色。將96孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基吸取出，并用PBS溶液小心洗滌孔內(nèi)的細(xì)胞3遍；之后使用移液槍吸取50μl 4%多聚甲醛，滴入96孔板內(nèi)，固定細(xì)胞20min；20min后吸取并棄去固定液，再次使用PBS清洗孔內(nèi)細(xì)胞，待培養(yǎng)孔風(fēng)干干燥后；將配置好的TRAP工作液200μl滴入孔內(nèi)，在避光的條件下37℃恒溫孵育2h；2h后使用移液槍吸取工作液，再次使用PBS清洗板孔；使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)，觀察到的紅色團(tuán)塊即為TRAP陽(yáng)性的破骨細(xì)胞。

6.F-actin環(huán)熒光染色：取96孔板孔徑大小的牛骨片，使用75%乙醇溶液浸泡并使用紫外照射牛骨片正反面2h消毒，使用雙抗洗滌后浸泡入無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)備用。將獲取的牛骨片平鋪在96孔板孔底部，將BMM細(xì)胞收集后種植于96孔板內(nèi)，等待其附著于牛骨片上，加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)光鏡下觀察到無(wú)骨片的孔內(nèi)出現(xiàn)破骨細(xì)胞時(shí)，再培養(yǎng)1天后將牛骨片取出，以備后續(xù)觀測(cè)。骨片取出后使用無(wú)菌PBS溶液清洗，每次10min，重復(fù)3次，之后使用4%多聚甲醛固定骨片10min，羅丹明鬼筆環(huán)肽染液于避光處進(jìn)行熒光染色30min，染色結(jié)束后使用DAPI染液染色5min，最后使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行攝片觀察。

7.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR) 檢測(cè)：將收集得到的BMM細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度種植于6孔板中，加入含有濃度梯度的紫云英苷破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(M-CSF 30ng/ml，RANKL 50ng/ml)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5天，提取總RNA。6孔板每孔加入350μl裂解液和350μl 70%乙醇，使用1ml移液槍吹打混勻后移至紅色柱內(nèi)；多次離心后棄去柱子下部液體；更換下面的柱子，將剩余柱子放入1.5ml的EP管內(nèi)，加入30μl的DEPC水；最后4℃ 12000r/min下離心1min，在1.5ml EP管內(nèi)收集得到總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37℃ 15min； 70℃ 10min)，得到cDNA。使用得到的cDNA與破骨分化基因引物(TRAP, CTSK, NFATc1)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。相關(guān)引物序列如下：TRAP：上游引物: 5′-TGGATTCATGGGTGGTGCTG-3′，下游引物:5′-AGCCACAAATCTCAGGGTGG-3′；CTSK：上游引物:5′-CACCCTTAGTCTTCCGCTCA-3′，下游引物:5′-CTTGAACACCCACATCCTGCT-3′；NFATc1：上游引物:5′-CATGCGAGCCATCATCGACT-3′，下游引物:5′-AGTTATGGCCAGACAGCACC-3′；GAPDH：上游引物:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物:5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.紫云英苷對(duì)BMM細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性:CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明紫云英苷僅在高濃度時(shí)(400、800μmol/L)對(duì)BMM細(xì)胞的增殖出現(xiàn)了明顯的抑制作用(P<0.01)。而實(shí)驗(yàn)中常規(guī)使用的紫云英苷濃度為100μmol/L，因此紫云英苷的使用不會(huì)對(duì)BMM細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，也不會(huì)對(duì)紫云英苷在破骨細(xì)胞分化方面的研究產(chǎn)生干擾(圖1A)。

圖1 不同濃度的紫云英苷對(duì)小鼠BMM細(xì)胞的毒性作用與TRAP染色A.小鼠BMM細(xì)胞的CCK-8活性檢測(cè)(相對(duì)于0μmol/L組)；B.每孔內(nèi)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)；C.TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞染色(×400)。與0μmol/L組比較，*P<0.01

2.紫云英苷體外抑制TRAP陽(yáng)性細(xì)胞形成：BMM細(xì)胞在RANKL的作用下能夠分化為破骨細(xì)胞，然而在紫云英苷的作用下，BMM誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的作用被抑制，50μmol/L的紫云英苷將BMM分化的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01，圖1B)，而在200μmol/L下過(guò)半的BMM的破骨分化都被抑制(圖1B)，破骨細(xì)胞的數(shù)量在200μmol/L作用下顯著減少(P<0.01)。紫云英苷不僅在低濃度時(shí)對(duì)破骨細(xì)胞分化有抑制作用，在高濃度下(200μmol/L)紫云英苷的抑制作用顯著增強(qiáng)，TRAP陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著下降(P<0.01，圖1)。

3.紫云英苷抑制F-actin環(huán)形成：在RANKL的作用下，骨片上形成了大量的F-actin環(huán)(圖2A)，證明RANKL誘導(dǎo)了破骨細(xì)胞的分化與骨吸收活動(dòng)。在紫云英苷的作用下，F(xiàn)-actin環(huán)的數(shù)量顯著下降(P<0.01，圖2B)，同時(shí)F-actin環(huán)的面積也相應(yīng)減小(圖2C)，且減少的幅度均與紫云英苷的濃度呈正相關(guān)。

圖2 不同濃度的紫云英苷處理下小鼠BMM形成的F-actin環(huán)A.F-actin環(huán)共聚焦熒光圖(羅丹明鬼筆環(huán)肽 DAPI，×400)；B.每孔F-actin環(huán)數(shù)；C.每孔相對(duì)F-actin環(huán)面積。與0μmol/L組比較，*P<0.01

4.紫云英苷抑制破骨分化基因表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示在RANKL的作用下，BMM細(xì)胞中成功檢測(cè)到了破骨分化相關(guān)的基因表達(dá)，RANKL成功誘導(dǎo)了BMM細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。同時(shí)，在紫云英苷的作用下，破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)于0μmol/L均下降(圖3)， 并且降低的效果呈現(xiàn)出濃度相關(guān)性，在低濃度時(shí)(50μmol/L)對(duì)破骨分化的抑制效果較低，下降的相對(duì)幅度不如100、200μmol/L組明顯，而在高濃度下(200μmol/L)紫云英苷對(duì)破骨相關(guān)基因表達(dá)的降低效果更加顯著(P<0.01)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)破骨分化相關(guān)基因的表達(dá)A.TRAP；B.CTSK;C.NFATc1。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

破骨細(xì)胞的異常激活造成骨吸收作用的亢進(jìn)，破骨細(xì)胞分化活動(dòng)在多種疾病中具有著重要作用[8,9]。類黃酮化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化活動(dòng)的抑制在多項(xiàng)研究中被報(bào)道，紫云英苷作為黃酮醇苷類化合物，具有潛在的抑制破骨細(xì)胞分化、維持骨量穩(wěn)定的能力，研究紫云英苷化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響有利于發(fā)掘治療的新方案[4,10,11]。

本實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠提取具有破骨細(xì)胞分化潛力的小鼠BMM細(xì)胞，使用RANKL誘導(dǎo)小鼠BMM向破骨細(xì)胞分化，并進(jìn)一步使用紫云英苷研究其對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示紫云英苷具有良好的生物相容性，對(duì)小鼠BMM細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，在TRAP染色中，紫云英苷顯著抑制了TRAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目，TRAP陽(yáng)性為破骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，顯示紫云英苷抑制了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。之后通過(guò)進(jìn)一步的RT-PCR檢測(cè)破骨相關(guān)基因TRAP、NFATc1、CTSK的表達(dá)，驗(yàn)證了基因?qū)用嫔献显朴④諏?duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)從體外的角度驗(yàn)證了紫云英苷抑制破骨細(xì)胞分化的作用。

破骨細(xì)胞的分化與多種因素有關(guān)，與多種細(xì)胞與信號(hào)通路有聯(lián)系，破骨細(xì)胞的增殖與分化受細(xì)胞因子M-CSF和RANKL的調(diào)控[12]。傳統(tǒng)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路與核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路是RANKL破骨分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要信號(hào)通路[13～15]。同時(shí)它們也是介導(dǎo)多種外部刺激與炎性反應(yīng)的重要通路，破骨細(xì)胞的激活還與RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)的平衡有關(guān)[16]。RANK表達(dá)于單核-吞噬細(xì)胞表面，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中高度表達(dá)，RANKL與RANK的結(jié)合是破骨細(xì)胞分化的重要核心，而OPG與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL位點(diǎn)從而調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[8, 9]。紫云英苷抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制及與其他信號(hào)通路之間的作用仍亟待開(kāi)展進(jìn)一步的研究，期待為未來(lái)骨關(guān)節(jié)疾病的預(yù)后與治療帶來(lái)新的思路。