嚴加坤,張寧寧,張歲岐

1 榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 榆林 719000 2 中國科學(xué)院水利部水土保持研究所土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室, 楊凌 712100

水分不足是限制干旱半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一[1],植物在長期的適應(yīng)干旱過程中進化出一系列的生理生化反應(yīng)來響應(yīng)環(huán)境水分變化[2- 3]。谷子(SetariaitalicaL.)是我國起源的特色作物,由于其具有較高營養(yǎng)價值,所以在全民營養(yǎng)危機[4]及種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的大背景下再次成為我國西北干旱半干旱地區(qū)廣泛種植的經(jīng)濟作物[5]。但由于西北地區(qū)降雨量小、月際分布不均,水分不足嚴重影響谷子產(chǎn)量,限制了谷子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,提高谷子的耐旱性并進行耐旱育種已成為保障谷子高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要途徑。

葉片光合作用是植物維持生長的物質(zhì)基礎(chǔ)。干旱引起植物葉片氣孔導(dǎo)度的降低,進而降低蒸騰速率,減少葉片蒸騰以改善植物水分狀態(tài)；然而這種調(diào)節(jié)會阻礙CO2進入葉片,最終由于氣孔限制影響光合作用[6]。研究顯示,提高干旱脅迫下高粱葉片氣孔導(dǎo)度能有效提高其凈光合速率[7]。但干旱脅迫妨礙光合色素的正常合成,并且會加速其分解,最終導(dǎo)致葉綠素含量下降。目前,不充分灌溉的灌溉制度導(dǎo)致玉米葉片葉綠素含量顯著降低[8], 因此,提高干旱脅迫下植物葉片葉綠素含量對維持光合作用具有重要意義。另外,干旱脅迫會降低作物光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)效率,影響作物體內(nèi)活性氧自由基代謝和脂膜流動性；通常植物通過增加可溶性糖和氨基酸含量(如：脯氨酸等)來調(diào)節(jié)細胞滲透勢,進而達到應(yīng)對干旱脅迫的目的[9]。干旱顯著提高谷子葉片脯氨酸、可溶性總糖、和淀粉含量以提高其抗旱性[9]。其中,可溶性糖和淀粉構(gòu)成的非結(jié)構(gòu)性碳在植物應(yīng)對非生物脅迫如：干旱、溫度、光照及鹽害中起重要作用[10-13]。研究表明：干旱脅迫誘導(dǎo)玉米葉片非結(jié)構(gòu)性碳積累提高玉米綜合抗旱性,且抗旱能力較強的玉米品種在干旱條件下具有更強的非結(jié)構(gòu)性碳積累能力[14]。劉亞靜等[9]對大氣CO2濃度升高和干旱互作對谷子生長的研究中發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下CO2濃度升高提高了可溶性糖含量,降低了淀粉含量從而緩解干旱脅迫對谷子的生長抑制?？梢?可溶性糖積累對谷子抗旱性的提高具有重要作用。對谷子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,干旱條件下谷子β-淀粉酶基因表達劇烈上調(diào)[15],而β-淀粉酶正是淀粉水解形成可溶性糖的直接催化劑。由此說明,非結(jié)構(gòu)性碳組成(淀粉/可溶性糖)可能是影響谷子抗旱性的重要因素。

長期以來,圍繞谷子適應(yīng)干旱機理方面國內(nèi)外做了大量研究,取得了重要的研究成果,如干旱下谷子氣孔調(diào)控機理[16]、篩選出一批重要的抗旱基因[17-19]。然而大部分研究主要集中在苗期滲透脅迫等[20]方面,對干旱條件下谷子重要生育期光合響應(yīng)特征及非結(jié)構(gòu)性碳代謝缺少深入研究,而谷子是我國典型的抗旱耐瘠特色作物,因此研究谷子的抗旱過程中光合及碳代謝響應(yīng)機制具有重要理論意義。本文擬采用盆栽控水的方法,研究(1)不同抗旱性谷子品種響應(yīng)干旱脅迫的光合特征,功能葉片非結(jié)構(gòu)性碳組成及相關(guān)基因表達情況，(2)外源施用β-淀粉酶活性抑制劑α-環(huán)糊精[21]條件下谷子各生理指標的變化旨在為進一步分析探索碳代謝在谷子逆境應(yīng)答中的功能和機制提供一些有益線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設(shè)計

(1)試驗1 不同抗旱性谷子品種干旱適應(yīng)特征研究

以干旱敏感谷子品種安04(An04)和抗旱性較強的品種豫谷1號(Yugu1)為材料[15],試驗所用種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院韓淵懷教授提供。

試驗在防雨棚內(nèi)進行,試驗材料種植在圓柱形塑料桶(高30 cm,直徑30 cm)內(nèi),試驗所用土壤為大田20 cm表層的黃綿土(有機質(zhì)3.2 g/kg,pH 8.6,全氮0.3 g/kg,全磷0.5 g/kg,全鉀18.3 g/kg,堿解氮16.1 mg/kg,速效磷4.8 mg/kg,速效鉀65.8 mg/kg),每桶裝入風干土8.5 kg,基礎(chǔ)肥料施用同當?shù)厣a(chǎn)水平一致,在拔節(jié)期追肥。種子均勻點播于土壤表層2 cm處,每個品種種植30盆、共60盆,并且控制土壤含水量為田間持水量75%±5%,每天18:00通過人工稱重補充水分。待幼苗長至3葉期選取長勢一致的幼苗定苗至每盆4株,土壤表面添加2 cm高蛭石保水,同時開始控水試驗。試驗設(shè)置正常供水組(WW)：保持土壤水分為田間持水量75%±5%,干旱處理組(WD)：3葉期后保持土壤水分為田間持水量35%±5%。分別在拔節(jié)期和開花期取樣進行生理指標測定,在成熟期測產(chǎn)。

(2)試驗2 β-淀粉酶功能驗證

為驗證β-淀粉酶在谷子抗旱中的作用設(shè)計試驗2,以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)最新創(chuàng)制xiaomi[22]為材料,在室內(nèi)人工氣候箱進行。試驗材料種植在圓形塑料桶(高15 cm,直徑10 cm)內(nèi),試驗所用土壤為草炭土(Pindstrup Mosebrug A/S,Ryomgaard, Denmark),播種方法同試驗1；種子出苗后每盆定苗3株,長至3葉期開始干旱處理。試驗設(shè)置四組：正常供水組(WW)：保持充分供水；正常供水+α-環(huán)糊精組(WWα)：保持充分供水并且每兩天葉片噴施20 mmol/L α-環(huán)糊精；干旱處理組(WD)：停止?jié)菜?自然干旱；干旱處理+α-環(huán)糊精組(WDα)：停止?jié)菜⑶颐績商烊~片噴施20 mmol/L α-環(huán)糊精。α-環(huán)糊精噴施以沾濕葉片為準,對照噴施相同劑量的純凈水。試驗處理10天后進行各生理指標的測定。

表1 實時定量PCR所用引物信息

1.2 測定內(nèi)容和方法

1.2.1生物量、測產(chǎn)及相關(guān)指標

試驗 1：在拔節(jié)期和開花期分別取5株測定地上部生物量。取地上部分分別裝入樣品袋,105 ℃ 殺青25 min,75 ℃烘干至恒重后稱重,即為地上部生物量。在成熟期測產(chǎn),地上部分按盆收取之后 75 ℃ 烘干至恒重后稱重即為地上部生物量,之后手工脫粒稱取粒重,即為每盆產(chǎn)量。通過人工數(shù)粒測定千粒重。在花后15天用卷尺測量植株拉直后的最大高度作為株高,每處理重復(fù)10次。用直尺測定旗葉長度并測定最寬處的寬度。

試驗2：取8株測定地上部生物量,方法同試驗1。

1.2.2光合參數(shù)及葉片指標

試驗1：光合參數(shù)采用Li-6400便攜式光合儀(LI-COR Inc., Lincoln,NE,USA),分別在拔節(jié)期、開花期及花后10天測定。具體方法為：在晴天10:00—1:00 am 測定完全展開的新葉(拔節(jié)期)、旗葉(開花期及花后10天)的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率,測定參數(shù)設(shè)定為光量子密度1000 μmol m-2s-1、 流量 500 μmol/s、葉溫28 ℃。采用PhotosynQ MultispeQ V2[23]測定儀測定光系統(tǒng)II最大化學(xué)效率(Fv/Fm)；采用乙醇浸提比色法[24]測定拔節(jié)期新葉及開花期旗葉葉綠素含量；采用硫酸蒽酮比色法[24]測定可溶性糖和淀粉含量；采用Barrs and Weatherley方法[25]測定葉片相對含水量。

開花期取樣,液氮冷凍后放入超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆?試驗所用引物序列見表1。

采用全式金EasyPure? Plant RNA Kit提取總RNA,經(jīng)EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄后使用TransStart? Tip Green qPCR SuperMix利用FTC—3000P實時熒光定量PCR儀進行實時定量測定,數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt[26]法計算。

試驗2：采樣后分別測定β-淀粉酶活性[27],淀粉和可溶性糖含量[24]及脯氨酸[24]含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0進行ANOVA 方差分析,用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較,顯著性水平為P=0.05。采用Sigmaplot12.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱對兩個品種谷子生物量、產(chǎn)量及相關(guān)性狀的影響

由表2可知,干旱脅迫嚴重限制了兩個谷子品種的產(chǎn)量形成(安04和豫谷1號分別減產(chǎn)71.2%和56.0%),但其對不同品種的生物量和產(chǎn)量的影響程度不同。正常水分條件下,兩個谷子品種地上部生物量在拔節(jié)期和開花期均不存在顯著性差異(P>0.05)；而干旱脅迫下,豫谷1號的地上部生物量顯著高于安04的地上部生物量(P<0.05)。在成熟期,正常水分條件下,安04的生物量和產(chǎn)量比豫谷1號分別高7.1%和12.4%；但干旱脅迫下,豫谷1號具有更高的生物量和產(chǎn)量,比安04分別高27%和35.7%(P<0.05),表明豫谷1號比安04具有更強的維持產(chǎn)量的能力；但干旱脅迫并沒有對兩個谷子品種千粒重產(chǎn)生顯著性影響(P>0.05)。

表2 不同水分條件下兩個谷子品種谷子產(chǎn)量及其相關(guān)性狀

干旱脅迫顯著降低了兩個谷子品種的株高和旗葉葉長(圖1),其中安04株高下降幅度(30.8%)大于豫谷1號下降幅度(21.2%)；雖然干旱脅迫顯著降低了旗葉葉長,但品種種間并不存在顯著性差異(P>0.05)。干旱脅迫雖顯著降低了安04的旗葉寬度(P<0.05),但其對豫谷1號并沒有產(chǎn)生顯著性影響(P>0.05)。

圖1 不同水分條件下兩個谷子品種株高、旗葉葉長和葉寬Fig.1 Plant height, flag leaf length and leaf width of two millet cultivars under different water conditionsWW：正常供水 Well-watered；WD：水分匱缺(干旱) Water deficit

2.2 干旱對兩個谷子品種谷子葉片光合及水分參數(shù)的影響

兩個谷子品種的葉片凈光合速率在各生育期均呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(圖2)。正常水分條件下,安04的葉片凈光合速率高于豫谷1號,且在開花期和花后10天均達到顯著性水平(P<0.05)；但干旱脅迫下,豫谷1號的葉片凈光合速率在不同生育期均顯著大于安04(P<0.05)。然而,兩個谷子品種的最大光化學(xué)效率在拔節(jié)期各處理及各品種間均不存在顯著性差異(P>0.05),但干旱脅迫下,開花期及花后10天,豫谷1號的最大光化學(xué)效率顯著高于安04(P<0.05)。

圖2 不同水分條件下兩個谷子品種的光合相關(guān)參數(shù)Fig.2 Photosynthetic parameters of the two millet cultivars under different water conditions不同字母代表顯著性差異(P<0.05)

拔節(jié)期,干旱脅迫顯著降低了安04的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量(表3),而同期豫谷1號中僅葉綠素a表現(xiàn)出顯著性降低現(xiàn)象(P<0.05)。開花期,兩個谷子品種的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均出現(xiàn)顯著性降低(表3),但安04降幅更大,其中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量分別降低45.9%、43.3%和43.3%,豫谷1號分別降低43.9%、28.2%和29.1%。

圖3顯示,在兩種水分條件下,兩個谷子品種的葉片氣孔導(dǎo)度呈現(xiàn)完全相反的現(xiàn)象,蒸騰速率的變化趨勢與葉片氣孔導(dǎo)度完全一致。正常水分條件下,拔節(jié)期和開花期安04的葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均顯著大于豫谷1號(P<0.05)。而干旱脅迫下,豫谷1號的葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均顯著大于安04(P<0.05)。而兩個谷子品種的葉片相對含水量表現(xiàn)不同,正常水分條件下,拔節(jié)期及開花期安04和豫谷1號葉片相對含水量無顯著性差異(P>0.05)；但干旱脅迫下,安04葉片相對含水量顯著低于豫谷1號(P<0.05)。

表3 不同水分條件下兩個谷子品種的葉綠素含量

圖3 不同水分條件下兩個谷子品種葉片水分參數(shù)Fig.3 Leaf water parameters of two millet cultivars under different water conditions

2.3 葉片非結(jié)構(gòu)性碳及相關(guān)基因表達

圖4顯示,干旱脅迫均顯著增加了拔節(jié)期和開花期豫谷1號的葉片可溶性糖含量(P<0.05),但安04葉片可溶性糖含量沒有發(fā)生顯著性變化(P>0.05)。然而,干旱脅迫對兩個谷子品種葉片淀粉含量的影響顯著不同,其中拔節(jié)期,干旱脅迫顯著性降低了安04葉片的淀粉含量(P<0.05),但豫谷1號葉片的淀粉含量則呈現(xiàn)出升高的趨勢；開花期,兩個谷子品種葉片的淀粉含量沒有表現(xiàn)出顯著性差異。同時,干旱脅迫下豫谷1號在拔節(jié)期和開花期均表現(xiàn)出更高的葉片非結(jié)構(gòu)性碳的積累(P<0.05),而安04 葉片非結(jié)構(gòu)性碳在兩種水分條件下并不具有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同水分條件下兩個谷子品種葉片非結(jié)構(gòu)性碳組成Fig.4 Leaf unstructured carbon of two millet cultivars under different water conditions

開花期旗葉β-淀粉酶基因表達結(jié)果顯示：干旱脅迫顯著提高了SiBAM1基因表達水平(圖5)。干旱脅迫下,安04SiBAM1a表達水平為正常水分下1.80倍,SiBAM1b為正常水分下1.78倍；豫谷1號SiBAM1a表達水平為正常水分下4.87倍,SiBAM1b為正常水分下6.05倍。表明干旱脅迫下,豫谷1號β-淀粉酶基因在旗葉中表達增量顯著高于安04(P<0.05)。

圖5 開花期旗葉β-淀粉酶基因表達Fig.5 Gene expression of β-amylase in flag leaf at anthesis stageSiBAM1a：谷子β-淀粉酶1a Setaria italica β-amylase 1a；SiBAM1b：谷子β-淀粉酶1b Setaria italica β-amylase 1b

2.4 β-淀粉酶基因功能驗證

如圖6所示,干旱脅迫顯著降低了xiaomi生物量(50.7%),外源施用α-環(huán)糊精進一步加劇了干旱導(dǎo)致的生長抑制。β-淀粉酶活性分析顯示,外源施用α-環(huán)糊精顯著抑制了不同水分條件下xiaomi葉片β-淀粉酶活性。而β-淀粉酶活性降低導(dǎo)致淀粉水解受到抑制,表現(xiàn)為干旱脅迫下xiaomi葉片具有更高的淀粉含量和更低的可溶性糖含量。脯氨酸含量結(jié)果表明,外源施用α-環(huán)糊精顯著降低了兩種水分條件下的脯氨酸含量。

圖6 外源α-環(huán)糊精對干旱脅迫下谷子xiaomi生物量、β-淀粉酶活性、可溶性糖和淀粉及脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of exogenous α-Cyclodextrin on biomass, β-amylase activity, soluble sugar, starch and proline content of millet under water deficit conditionWWα：正常供水+ α-環(huán)糊精 Well-watered+α-cyclodextrin；WDα：水分匱缺(干旱)+ α-環(huán)糊精 Water deficit+α-cyclodextrin

3 討論

3.1 干旱對谷子光合參數(shù)的影響

干旱導(dǎo)致作物光合速率降低[7, 28],而提高葉片凈光合速率是提高干旱脅迫下作物產(chǎn)量的重要途徑[29-30]。本研究中不同抗旱性谷子品種在干旱脅迫下呈現(xiàn)出不同的光合響應(yīng)模式,總體表現(xiàn)為高光合速率對應(yīng)較高的籽粒產(chǎn)量,這與前人研究結(jié)果相一致[30]。光合速率的降低主要是由于氣孔關(guān)閉導(dǎo)致的氣孔限制和光合色素的降解及合成受阻等造成的非氣孔限制引起的[31]。本實驗中安04谷子葉片氣孔導(dǎo)度下降幅度遠大于豫谷1號(圖3),說明安04降低的光合速率可能受到氣孔限制的影響要大于豫谷1號。最大化學(xué)效率Fv/Fm反映光系統(tǒng)反應(yīng)中心利用光能的最大能力,是脅迫條件下光系統(tǒng)受損程度的判定標準之一[32]。本研究中拔節(jié)期兩種水分條件下各品種Fv/Fm并不存在顯著性差異,說明在脅迫初期光系統(tǒng)損害程度較輕；而葉綠素含量則出現(xiàn)顯著性差異,但其下降的幅度遠小于開花期,說明谷子葉片葉綠素含量輕微下降對光系統(tǒng)損傷影響較小。開花期葉片凈光合速率的下降可能是干旱誘導(dǎo)的葉綠素降解或合成受阻導(dǎo)致光系統(tǒng)損害程度和氣孔限制雙重影響的結(jié)果；而干旱誘導(dǎo)葉綠素降解或合成受阻可能與葉片的水分狀況有關(guān),如豫谷1號維持了相對更高的葉片相對含水量,提高葉片相對含水量有助于緩解干旱對作物植株的傷害進而提高其對干旱的耐受能力[33]。

3.2 β-淀粉酶與改善谷子抗旱性

干旱脅迫下,非結(jié)構(gòu)性碳積累對植物響應(yīng)脅迫具有重要作用[34-35]。干旱脅迫下,麻櫟幼苗會提高整株非結(jié)構(gòu)性碳水平而提高葉片非結(jié)構(gòu)性碳含量,說明非結(jié)構(gòu)性碳含量積累可能有助于與抗旱性的提高[34]；而馬鈴薯則提高塊莖中非結(jié)構(gòu)性碳含量來緩解干旱脅迫導(dǎo)致的產(chǎn)量抑制[35]；因此,葉片的非結(jié)構(gòu)性碳積累是植物抗性提高的重要因素之一。本研究中抗旱性較強的豫谷1號其功能葉片非結(jié)構(gòu)性碳含量要高于安04,并且干旱脅迫顯著誘導(dǎo)了豫谷1號非結(jié)構(gòu)性碳積累,這種在干旱脅迫下葉片非結(jié)構(gòu)性碳急劇積累有可能是豫谷1號維持較高光合速率及產(chǎn)量的重要機制之一。

淀粉是植物夜間新陳代謝所需的重要物質(zhì)來源,可溶性糖是植物呼吸作用的能量基礎(chǔ)。長期干旱脅迫顯著提高了高粱葉片可溶性糖含量,而淀粉含量雖有提高但并不顯著[36]；本研究中抗旱性較強品種積累了更高的可溶性糖,說明可溶性積累可能是植物抵御干旱的重要途徑。干旱脅迫下,刺槐幼苗可能通過將葉片內(nèi)臨時存儲的少量淀粉轉(zhuǎn)化成其直接利用的可溶性糖的方式,以維持其正常的新陳代謝[37]。β-淀粉酶介導(dǎo)的淀粉分解是可溶性糖形成的最主要來源。煙草中超表達枳PtrBAM1基因能有效提高β-淀粉酶活性誘導(dǎo)蔗糖和可溶性糖積累從而提高煙草對冷脅迫和凍害的抗性,而檸檬PtrBAM1突變體則由于不能誘導(dǎo)蔗糖和可溶性糖積累而降低其抗冷性[38]。滲透脅迫導(dǎo)致擬南芥AtBAM1表達從而降低光照條件下淀粉積累提高可溶性糖含量來適應(yīng)水分變化[39]。在茶樹中,通過調(diào)控BAM表達和活性來增強茶樹對干旱等脅迫的抗性也已得到證實[40]。本研究中干旱脅迫下豫谷1號大幅度上調(diào)SiBAM1a和SiBAM1b基因表達,這可能是谷子葉片可溶性糖積累的重要原因之一。

外源施用β-淀粉酶活性專一性抑制劑α-環(huán)糊精進一步降低了干旱脅迫下谷子生物量積累,并且可溶性糖含量顯著減少(圖6),說明β-淀粉酶水解淀粉是谷子葉片可溶性糖積累的主要來源。此外,α-環(huán)糊精顯著降低了葉片脯氨酸含量,這與Zanella等[41]研究發(fā)現(xiàn)β-amylase 1干旱脅迫下水分淀粉以維持脯氨酸合成的結(jié)果相一致；而可溶性糖和脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對維持細胞正常的含水量和膨壓具有重要作用[42]。因此,干旱脅迫誘導(dǎo)谷子β-淀粉酶基因表達及β-淀粉酶活性升高,從而提高淀粉水解形成可溶性糖及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量是谷子抗旱性改善的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

干旱脅迫顯著抑制了光合速率等相關(guān)性狀,進而影響谷子產(chǎn)量,谷子可以通過提高β-淀粉酶基因表達及活性來適應(yīng)干旱；干旱脅迫下,提高谷子β-淀粉酶活性,加強淀粉水解成可溶性糖,進一步影響葉片脯氨酸的合成對提高谷子抗旱性具有重要作用。抗旱性較強的谷子品種豫谷1號通過維持較高的葉片葉綠素含量、凈光合速率、光系統(tǒng)II最大化學(xué)效率及葉片相對含水量等途徑,從而獲得較高的產(chǎn)量,與β-淀粉酶介導(dǎo)的淀粉分解導(dǎo)致可溶性糖積累有重要關(guān)系。此外,干旱脅迫下,豫谷1號具有較高葉片蒸騰的情況下,依然維持高的葉片相對含水量可能與其根系吸水能力有關(guān),需要進一步試驗研究。

致謝：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)王興春教授提供xiaomi系列材料。