張偉利， 決利利， 李曉婷

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451150)

根皮素作為黃酮多酚類(lèi)化合物，主要存在于蘋(píng)果、梨等水果的根莖中，具有抗糖尿病、抗氧化、抗菌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗前列腺癌等多種藥理作用[1-2]，但該成分在25 ℃水中的溶解度僅為33.64 μg/mL，溶出速率、溶出度均較低，可能會(huì)導(dǎo)致其口服吸收困難[3]，從而影響藥效發(fā)揮。因此，提高根皮素的溶解度及溶出度、改善口服吸收生物利用度是首要解決的問(wèn)題，目前該成分劑型主要有包合物[4]、磷脂復(fù)合物[5]、固體分散體[3]等。

納米混懸劑具有載藥量大、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，可顯著提高溶解度及口服吸收生物利用度，該技術(shù)是將藥物與穩(wěn)定劑(如PVP K30、SDS、泊洛沙姆188等)通過(guò)某種制劑手段(高壓均質(zhì)、超聲等)所得到的膠態(tài)分散體系[6-9]，工業(yè)化應(yīng)用程度相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察穩(wěn)定劑種類(lèi)、用量、超聲功率等對(duì)根皮素納米混懸劑粒徑、PDI的影響，確定制備工藝，再測(cè)定其粒徑、Zeta電位、載藥量、溶解度、溶出度等情況，最后考察其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，以期為該劑型進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置DAD檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Agilent公司)；MSE 125P-CE型電子天平(配置防風(fēng)罩，德國(guó)Sartorius公司)；C-MAG-HS7型恒溫加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)；ATS型均質(zhì)機(jī)(美國(guó)Seeker公司)；BDF-86H50型超低溫冰箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；Nano-S90型粒度分析儀(馬爾文帕納科公司)；TYH-2型氮?dú)獯祾邇x(廣西大學(xué)附屬科學(xué)儀器有限公司)。

根皮素原料藥(批號(hào)191005-2，純度98.0%，成都嘉葉生物科技有限公司)；根皮素對(duì)照品(批號(hào)P7912，純度99.9%，美國(guó)Sigma公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批號(hào)240379，美國(guó)Ashland公司)；十二烷基磺酸鈉(SDS，批號(hào)171114，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；泊洛沙姆188(批號(hào)171225，山河藥用輔料有限公司)。

SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量(300±20)g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(豫)2016-0001，飼養(yǎng)溫度、相對(duì)濕度分別為25 ℃、55%。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定根皮素含量

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(35∶65)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 稱(chēng)根皮素對(duì)照品20.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入約80 mL乙腈超聲提取3 min溶解，乙腈定容至0.2 mg/mL，作為貯備液，再配制500 mL 乙腈-水(35∶65)混合液，作為稀釋液。精密量取10 mL貯備液，置于100 mL量瓶中，稀釋液定容，即得20.0 μg/mL對(duì)照品溶液，稀釋液依次稀釋至10.0、5.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(Y)對(duì)根皮素質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=12.941 8X+44.066 1(r=0.999 9)，在0.05～20.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.3 方法學(xué)考察 取根皮素納米混懸劑1.0 mL至10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項(xiàng)下稀釋液定容，即得供試品溶液。取同一份樣品，平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得根皮素峰面積RSD為1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得根皮素峰面積RSD為1.17%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20.0、5.0、0.05 μg/mL對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得根皮素峰面積RSD分別為0.28%、0.13%、0.21%，表明儀器精密度良好。精密稱(chēng)取根皮素對(duì)照品12.0 mg，置于10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，即得1.2 mg/mL對(duì)照品溶液，再取9份根皮素納米混懸劑，每份1.0 mL，置于10 mL量瓶中，分為3組，分別加入對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，再加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項(xiàng)下稀釋液定容，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得加樣回收率分別為100.19%、99.67%、100.37%，RSD分別為0.63%、1.31%、0.94%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 穩(wěn)定劑種類(lèi) 固定穩(wěn)定劑用量為30 mg，考察不同穩(wěn)定劑(PVP K30、SDS、泊洛沙姆188)及其組合(PVP K30+SDS、PVP K30+泊洛沙姆188、SDS+泊洛沙姆188，比例均為1∶1)對(duì)納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，PVP K30+泊洛沙姆188作為穩(wěn)定劑時(shí)粒徑、PDI均較低。

表1 穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)粒徑、PDI的影響

2.2.2 穩(wěn)定劑比例 固定穩(wěn)定劑用量為30 mg，考察PVP K30+泊洛沙姆188不同比例(1∶2、1∶1、2∶1)對(duì)納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1時(shí)粒徑、PDI均較低。

表2 穩(wěn)定劑比例對(duì)粒徑、PDI的影響

2.2.3 穩(wěn)定劑用量 固定PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，考察不同穩(wěn)定劑用量(20、30、40、50、60 mg)對(duì)納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，穩(wěn)定劑用量過(guò)大或過(guò)小均會(huì)對(duì)粒徑、PDI產(chǎn)生影響，在40 mg時(shí)兩者均較低，而超過(guò)40 mg時(shí)粒徑反而上升，可能是過(guò)多的穩(wěn)定劑吸附在納米粒子表面所致。

表3 穩(wěn)定劑用量對(duì)粒徑、PDI的影響

2.2.4 超聲功率 固定根皮素用量為60 mg，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，穩(wěn)定劑用量為40 mg，考察不同超聲功率(200、250、300、350、400 W)對(duì)納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，超聲功率為350 W時(shí)粒徑、PDI均較低，而進(jìn)一步增加時(shí)粒徑反而有所升高，可能是功率過(guò)高可提升納米粒子碰撞幾率所致[9]。

表4 超聲功率對(duì)粒徑、PDI的影響

2.2.5 超聲時(shí)間 固定根皮素用量為60 mg，PVP K30與泊洛沙姆188比例為1∶1，穩(wěn)定劑用量為40 mg，超聲功率為350 W，考察不同超聲時(shí)間(20、25、30、35 min)對(duì)納米混懸劑粒徑、PDI的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，超聲時(shí)間為30 min時(shí)粒徑、PDI均較低，而進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)兩者反而有所升高。

表5 超聲時(shí)間對(duì)粒徑、PDI的影響

2.2.6 制備工藝確定 取60 mg根皮素，置于圓底燒瓶中，加入10 mL無(wú)水乙醇得混懸液，磁力攪拌(50 ℃)2.5 h至溶液澄清，作為有機(jī)相；稱(chēng)取PVP K30、泊洛沙姆188(比例為1∶1)共40 mg，加入50 mL蒸餾水溶解，作為水相，將有機(jī)相滴加至水相中，繼續(xù)磁力攪拌攪拌2 h，再置于超聲儀中超聲處理30 min(功率350 W，每工作2 s停止2 s)，加入蒸餾水至50 mL，即得。

2.3 納米混懸劑表征

2.3.1 粒徑、Zeta電位 平行制備3批納米混懸劑，蒸餾水稀釋50倍，混勻，取約3 mL至比色皿中，測(cè)定粒徑、Zeta電位，結(jié)果分別見(jiàn)圖1～2。由此可知，其平均粒徑為167.2 nm，RSD為0.95%；平均PDI為0.138，RSD為0.67%；平均Zeta電位為-36.4 mV，RSD為0.77%，表明處方和工藝重復(fù)性良好。

圖1 納米混懸劑粒徑分布

圖2 納米混懸劑Zeta電位

2.3.2 載藥量 取納米混懸劑1.0 mL至超濾離心管中，8 000 r/min離心10 min，取外管濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離根皮素量(M游離)；取根皮素納米混懸劑1.0 mL至10 mL量瓶中，加入約7 mL乙腈超聲處理3 min后定容，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液0.5 mL至10 mL量瓶中，“2.1.2”項(xiàng)下稀釋液定容，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定根皮素總量(M總藥)；取1.0 mL根皮素納米混懸劑，凍干(不加凍干保護(hù)劑)，稱(chēng)定質(zhì)量(M總)，平行3次，計(jì)算載藥量，公式為載藥量=[(M總藥-M游離)/M總]×100%，測(cè)得其平均值為51.43%，RSD為0.82%。

2.4 凍干粉制備及其溶解度測(cè)定 取納米混懸劑適量，加入4%甘露醇混勻，分成若干份，每份約4 mL，置于-50 ℃冰箱中預(yù)凍2 d，再迅速置于-30 ℃真空狀態(tài)的冷凍干燥機(jī)中2 d，于3 h內(nèi)勻速升溫至25 ℃，繼續(xù)保持3 h后取出，即得，見(jiàn)圖3。取適量蒸餾水復(fù)溶，測(cè)得其平均粒徑為193.4 nm，平均PDI為0.166，平均Zeta電位為-27.7 mV，見(jiàn)圖4～5。

圖3 凍干粉外觀(guān)

圖4 凍干粉復(fù)溶后粒徑分布

圖5 凍干粉復(fù)溶后Zeta電位

取過(guò)量根皮素、物理混合物(根皮素-輔料，兩者比例同納米混懸劑)、納米混懸劑凍干粉，置于三角燒瓶中，加入蒸餾水得混懸液，固定于振蕩器上，設(shè)置溫度、轉(zhuǎn)速分別為25 ℃、100 r/min，振蕩2 d后取出，12 500 r/min離心15 min，吸取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，根皮素、物理混合物溶解度分別為33.64、68.27 μg/mL，推測(cè)后者溶解度升高可能與處方中含有表面活性劑有關(guān)；納米混懸劑凍干粉溶解度達(dá)867.35 μg/mL，提高至25.78倍。

2.5 體外釋藥研究 取根皮素及其納米混懸劑凍干粉適量(以根皮素計(jì)均為8 mg)，置于離心管中，加入2 mL蒸餾水得混懸液，剪取透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)，去離子水煮沸20 min，常溫去離子水洗滌，將混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋中，細(xì)尼龍繩兩端扎緊，每份樣品平行制備3份。取蒸餾水適量，超聲處理30 min后量取900 mL，作為溶出介質(zhì)。在溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，從樣品接觸溶出介質(zhì)開(kāi)始計(jì)時(shí)，每個(gè)取樣點(diǎn)取樣3 mL后，立即補(bǔ)加3 mL超聲后蒸餾水，12 500 r/min離心15 min，吸取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，原料藥在240 min內(nèi)的溶出度僅為36.73%，而其納米混懸劑凍干粉末在45 min內(nèi)基本完全溶出。

圖6 根皮素體外釋藥曲線(xiàn)(n=3)

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.6.1 灌胃液制備、給藥及取血 取根皮素及其納米混懸劑凍干粉適量，加入0.5% CMC-Na溶液，超聲處理30 s，即得12.5 mg/mL灌胃液。取12只SD大鼠，拋幣法隨機(jī)分為2組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按100 mg/kg劑量灌胃給藥，于0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h取血各約0.3 mL，置于肝素浸潤(rùn)的離心管中，混勻后3 000 r/min離心約2 min(視情況延長(zhǎng)或縮短時(shí)間)，取上層血漿，保存于冰箱中。

2.6.2 血漿樣品處理 將血漿樣品在室溫下解凍后，精密吸取0.2 mL至空白離心管中，加入1 mL乙腈渦旋5 min，12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，45 ℃氮?dú)獯蹈桑?.2 mL乙腈復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.6.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 取5.0 μg/mL對(duì)照品溶液，乙腈依次稀釋至2 500、1 000、500、100、50、20 ng/mL，各取0.2 mL，45 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?.2 mL空白血漿，混勻，按“2.6.2”項(xiàng)下方法處理，即得血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，血漿對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.013 3X+0.461 5(r=0.994 2)，在20～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.6.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿樣品、血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖7，可知血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾根皮素色譜峰，專(zhuān)屬性良好。取血漿樣品6份，按“2.6.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得根皮素峰面積RSD為1.42%，表明該方法重復(fù)性良好。取20、500、2 500 ng/mL血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得根皮素峰面積RSD分別為7.31%、5.94%、2.34%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；各質(zhì)量濃度每天進(jìn)樣測(cè)定1次，連續(xù)6 d，測(cè)得根皮素峰面積RSD分別為10.11%、7.04%、4.87%，表明該方法日間精密度良好。取血漿樣品，于0、4、12、24、36、48 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得根皮素峰面積RSD為7.77%，表明該方法穩(wěn)定性良好。取2 500、500、20 ng/mL血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將實(shí)際質(zhì)量濃度與配制質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，測(cè)得加樣回收率分別為93.61%、89.25%、91.73%，RSD分別為7.01%、8.46%、9.08%。

1.根皮素

2.6.5 藥動(dòng)學(xué)研究 圖8、表6顯示，與原料藥比較，納米混懸劑tmax縮短(P<0.05)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對(duì)生物利用度增加至3.47倍，而物理混合物均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表6 根皮素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖8 根皮素血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)(n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶有根皮素的有機(jī)相接觸到水相時(shí)，乙醇會(huì)迅速擴(kuò)散到水相中，由于該成分在水中的溶解度較低，從而會(huì)析出形成納米級(jí)別的微小晶核，同時(shí)穩(wěn)定劑可形成空間阻力，有效防止晶核聚集[10-12]，最終形成納米混懸劑。與原料藥比較，納米混懸劑tmax顯著提前，可能是由于該劑型可提高根皮素溶出速率，加快了后者進(jìn)入體循環(huán)的速度；Cmax、生物利用度顯著升高，可能是由于納米混懸劑將根皮素的溶解度提高至25.78倍，后者溶出度、溶出速率也得到很大改善，表明該劑型可增加藥物與胃腸道的接觸面，有助于后者被充分吸收[13]，而且吸收途徑也發(fā)生了改變[14]。

馬記平等[5]采用磷脂復(fù)合物增溶技術(shù)提高了根皮素水溶性和脂溶性，但它由于黏性較大，導(dǎo)致溶出受限[15]；本實(shí)驗(yàn)制備的納米混懸劑不僅改善了藥物溶解度和溶出度，而且還能發(fā)揮納米制劑特殊的促吸收機(jī)制，使其口服生物利用度升高程度高于磷脂復(fù)合物[16]。另外，盡管納米混懸劑技術(shù)在促進(jìn)藥物體內(nèi)吸收、提高生物利用度方面得到了制劑研究人員的認(rèn)可，但不同藥物納米混懸劑促吸收的程度存在較大差別，可能與藥物本身性質(zhì)[17](如穩(wěn)定性、脂溶性等)、粒徑等因素有關(guān)，具體有待進(jìn)一步研究。